王宏成、徐博
應用研發中心
介紹
根據固定相和流動相的相對極性，液相色譜可分為正相色譜（NPC）和反相色譜（RPC）。對於RPC，流動相的極性強於固定相的極性。RPC因其效率高、分離度好、保留機制清晰等優點，成為液相色譜分離模式中應用最廣泛的一種。因此，RPC適用於各種極性或非極性化合物的分離純化，包括生物鹼、碳水化合物、脂肪酸、類固醇、核酸、氨基酸、肽、蛋白質等。在RPC中，最常用的固定相是矽膠基質上鍵合有各種官能團，包括C18、C8、C4、苯基、氰基、氨基等。在這些鍵合官能團中，應用最廣泛的是C18。據估計，目前超過80%的RPC正在使用C18鍵合相。因此C18層析柱已成為每個實驗室必備的通用柱。
雖然C18柱的應用範圍非常廣泛，但是，對於一些極性很大或親水性很高的樣品，常規C18柱在純化此類樣品時可能會出現問題。在RPC中，常用的洗脫溶劑按照極性排列可以為：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<異丙醇。為了確保這些樣品（強極性或高親水性）在柱上具有良好的保留，需要使用高比例的水系統作為流動相。但當使用純水體系（包括純水或純鹽溶液）作為流動相時，C18柱固定相上的長碳鏈往往會避開水而相互混合，導致色譜柱的吸附量瞬間下降。柱的保留能力下降甚至沒有保留。這種現象稱為“疏水相塌陷”（如圖1左側所示）。雖然用甲醇或乙腈等有機溶劑清洗色譜柱時這種情況是可逆的，但仍然會對色譜柱造成損壞。因此，有必要防止這種情況的發生。
圖1 常規C18柱（左）和C18AQ柱（右）矽膠表面鍵合相示意圖。
針對上述問題，色譜包裝材料生產廠家進行了技術改進。其中的改進之一是對矽膠基質的表面進行一些修飾，例如引入親水性氰基（如圖1右部所示），使矽膠表面更加親水。因此，二氧化矽表面的C18鏈可以在高水條件下完全延伸，並且可以避免疏水相崩潰。這些改良的C18柱被稱為水性C18柱，即C18AQ柱，它是為高水性洗脫條件而設計的，可以耐受100%水性體系。C18AQ色譜柱廣泛應用於強極性化合物的分離純化，包括有機酸、多肽、核苷和水溶性維生素等。
脫鹽是C18AQ色譜柱在樣品快速純化中的典型應用之一，去除樣品溶劑中的鹽或緩衝液成分，以利於樣品在後續研究中的應用。本文以強極性的亮藍FCF為樣品，並在C18AQ柱上進行純化。樣品溶劑被緩衝溶液中的有機溶劑替代，從而有利於隨後的旋轉蒸發，並節省溶劑和操作時間。此外，通過去除樣品中的一些雜質，提高了樣品的純度。
實驗部分
圖 2. 樣品的化學結構。
本文使用亮藍 FCF 作為樣品。原始樣品的純度為86%，樣品的化學結構如圖2所示。為了製備樣品溶液，將300mg亮藍FCF粉狀粗固體溶解在1M NaH2PO4緩衝溶液中，充分搖勻，成為完全澄清的溶液。然後通過注射器將樣品溶液注射到閃蒸柱中。閃蒸純化的實驗裝置列於表1中。
| 樂器 | SepaBean™ 機器2 | |||
| 墨盒 | 12 g SepaFlash C18 RP 閃蒸柱（球形矽膠，20 - 45 μm，100 Å，訂單號：SW-5222-012-SP） | 12 g SepaFlash C18AQ RP 閃蒸柱（球形矽膠，20 - 45 μm，100 Å，訂單號：SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| 波長 | 254納米 | |||
| 流動相 | 溶劑A：水 溶劑B：甲醇 | |||
| 流量 | 30毫升/分鐘 | |||
| 樣品裝載 | 300毫克（艷藍FCF，純度86%） | |||
| 坡度 | 時間（CV） | 溶劑B(%) | 時間（CV） | 溶劑B(%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
結果與討論
SepaFlash C18AQ RP 快速柱用於樣品脫鹽和純化。採用階梯梯度，其中在洗脫開始時使用純水作為流動相並運行 10 個柱體積 (CV)。如圖3所示，當使用純水作為流動相時，樣品完全保留在閃蒸柱上。接下來，將流動相中的甲醇直接增加至100%，並維持梯度7.5CV。樣品從 11.5 CV 洗脫到 13.5 CV。在收集的級分中，將樣品溶液從NaH2PO4緩衝溶液替換為甲醇。與高水溶液相比，甲醇在後續步驟中更容易通過旋轉蒸發去除，這有利於後續研究。
圖 3. C18AQ 柱上樣品的快速色譜圖。
為了比較C18AQ小柱和普通C18小柱對強極性樣品的保留行為，進行了平行比較試驗。使用 SepaFlash C18 RP 快速柱，樣品的快速色譜圖如圖 4 所示。對於常規 C18 柱，最高耐受的水相比率約為 90%。因此，起始梯度設置為 90% 水中的 10% 甲醇。如圖4所示，由於高水比導致C18鏈的疏水相塌陷，樣品在常規C18柱上幾乎沒有保留，直接被流動相洗脫。從而無法完成樣品脫鹽或純化的操作。
圖 4. 常規 C18 柱上樣品的快速色譜圖。
與線性漸變相比，使用階梯漸變有以下優點：
1. 減少樣品純化的溶劑使用量和運行時間。
2、目標產物以尖峰洗脫，減少了收集餾分的體積，有利於後續旋轉蒸發，節省時間。
3、收集的產物在甲醇中，易於蒸發，減少了乾燥時間。
總之，對於強極性或高親水性樣品的純化，SepaFlash C18AQ RP 快速柱與製備型快速色譜系統 SepaBean™ Machine 相結合可以提供快速高效的解決方案。
關於 SepaFlash Bonded 系列 C18 RP 閃存盒
三泰科技推出了一系列不同規格的SepaFlash C18AQ RP閃存盒（如表2所示）。
| 項目編號 | 柱尺寸 | 流量 （毫升/分鐘） | 最大壓力 （磅/平方英寸/巴） |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4克 | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20克 | 10-25日 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33克 | 10-25日 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48克 | 15-30日 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105克 | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155克 | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300克 | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420克 | 40-80 | 250/17.2 |
表 2. SepaFlash C18AQ RP 閃存盒。
填料：高效球形 C18(AQ) 鍵合矽膠，20 - 45 μm，100 Å。
邏輯（如表2所示）。
發佈時間：2018年8月27日