Hongcheng Wang, Bo Xu
Trung tâm R & D ứng dụng
Giới thiệu
Theo các phân cực tương đối của pha tĩnh và pha di động, sắc ký lỏng có thể được chia thành sắc ký pha bình thường (NPC) và sắc ký pha đảo ngược (RPC). Đối với RPC, độ phân cực của pha di động mạnh hơn giai đoạn đứng yên. RPC đã trở thành một trong những chế độ phân tách sắc ký lỏng được sử dụng rộng rãi do hiệu quả cao, độ phân giải tốt và cơ chế duy trì rõ ràng của nó. Do đó, RPC phù hợp để tách và tinh chế các hợp chất phân cực hoặc không phân cực khác nhau, bao gồm alkaloid, carbohydrate, axit béo, steroid, axit nucleic, axit amin, peptide, protein, v.v. Cyano, amino, v.v ... Trong số các nhóm chức năng ngoại quan này, nhóm được sử dụng rộng rãi nhất là C18. Người ta ước tính rằng hơn 80% RPC hiện đang sử dụng pha liên kết C18. Do đó, cột sắc ký C18 đã trở thành một cột phổ quát phải có cho mỗi phòng thí nghiệm.
Mặc dù cột C18 có thể được sử dụng trong một loạt các ứng dụng rất rộng, nhưng đối với một số mẫu rất cực hoặc ưa nước cao, các cột C18 thông thường có thể có vấn đề khi được sử dụng để tinh chế các mẫu đó. Trong RPC, các dung môi rửa giải thường được sử dụng có thể được sắp xếp theo phân cực của chúng: nước <methanol <acetonitrile <ethanol <tetrahydrofuran <isopropanol. Để đảm bảo khả năng duy trì tốt trên cột cho các mẫu này (cực mạnh hoặc ưa nước cao), tỷ lệ cao của hệ thống nước là cần thiết để được sử dụng làm pha di động. Tuy nhiên, khi sử dụng hệ thống nước tinh khiết (bao gồm cả nước tinh khiết hoặc dung dịch muối tinh khiết) làm pha di động, chuỗi carbon dài trên giai đoạn đứng yên của cột C18 có xu hướng tránh nước và trộn lẫn với nhau, dẫn đến giảm khả năng lưu giữ của cột hoặc thậm chí không lưu giữ. Hiện tượng này được gọi là sự sụp đổ pha kỵ nước của người Hồi giáo (như thể hiện ở phần bên trái của Hình 1). Mặc dù tình huống này có thể đảo ngược khi cột được rửa bằng các dung môi hữu cơ như metanol hoặc acetonitril, nhưng nó vẫn có thể gây ra thiệt hại cho cột. Do đó, cần phải ngăn chặn tình huống này xảy ra.
Hình 1. Sơ đồ của các pha liên kết trên bề mặt silica gel trong cột C18 thông thường (trái) và cột C18AQ (phải).
Để giải quyết các vấn đề được đề cập ở trên, các nhà sản xuất vật liệu đóng gói sắc ký đã thực hiện các cải tiến kỹ thuật. Một trong những cải tiến này là thực hiện một số sửa đổi trên bề mặt của ma trận silica, chẳng hạn như sự ra đời của các nhóm cyano ưa nước (như trong phần bên phải của Hình 1), để làm cho bề mặt của silica gel ưa nước hơn. Do đó, các chuỗi C18 trên bề mặt silica có thể được mở rộng hoàn toàn trong điều kiện nước cao và có thể tránh được sự sụp đổ pha kỵ nước. Các cột C18 đã được sửa đổi này được gọi là các cột C18 nước, cụ thể là các cột C18AQ, được thiết kế cho các điều kiện rửa giải bằng nước cao và có thể chịu được hệ thống nước 100%. Các cột C18AQ đã được áp dụng rộng rãi trong việc tách và tinh chế các hợp chất cực mạnh, bao gồm axit hữu cơ, peptide, nucleoside và vitamin tan trong nước.
Giả thuyết là một trong những ứng dụng điển hình của các cột C18AQ trong tinh chế flash cho các mẫu, loại bỏ các thành phần muối hoặc đệm trong dung môi mẫu để tạo điều kiện áp dụng mẫu trong các nghiên cứu tiếp theo. Trong bài đăng này, FCF màu xanh rực rỡ với độ phân cực mạnh đã được sử dụng làm mẫu và được tinh chế trên cột C18AQ. Dung môi mẫu được thay thế bằng dung môi hữu cơ từ dung dịch đệm, do đó tạo điều kiện cho sự bay hơi quay sau đây cũng như tiết kiệm dung môi và thời gian hoạt động. Hơn nữa, độ tinh khiết của mẫu đã được cải thiện bằng cách loại bỏ một số tạp chất trong mẫu.
Phần thử nghiệm
Hình 2. Cấu trúc hóa học của mẫu.
FCF màu xanh rực rỡ đã được sử dụng làm mẫu trong bài đăng này. Độ tinh khiết của mẫu thô là 86% và cấu trúc hóa học của mẫu được thể hiện trong Hình 2. Để chuẩn bị dung dịch mẫu, chất rắn thô 300 mg của FCF màu xanh rực rỡ đã được hòa tan trong dung dịch đệm 1 m NAH2PO4 và làm rung chuyển tốt để trở thành một giải pháp hoàn toàn rõ ràng. Dung dịch mẫu sau đó được tiêm vào cột flash bởi một kim phun. Thiết lập thử nghiệm của tinh chế flash được liệt kê trong Bảng 1.
| Dụng cụ | Máy Sepabean ™2 | |||
| Hộp mực | 12 g hộp flash sepaflash c18 RP (silica hình cầu, 20-45 m, 100, số thứ tự: SW-5222-012-SP) | 12 G SEPAFLASH C18AQ RP FLASH Hộp mực (silica hình cầu, 20-45 m, 100, số thứ tự SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Bước sóng | 254nm | |||
| Giai đoạn di động | Dung môi một nước Dung môi B ： Methanol | |||
| Tốc độ dòng chảy | 30 ml/phút | |||
| Tải mẫu | 300 mg (FCF màu xanh rực rỡ với độ tinh khiết 86%) | |||
| Độ dốc | Thời gian (CV) | Dung môi B (%) | Thời gian (CV) | Dung môi B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17,5 | 100 | 17,5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Kết quả và thảo luận
Một hộp mực flash RP Sepaflash C18AQ đã được sử dụng để khử muối và tinh chế mẫu. Độ dốc bước được sử dụng trong đó nước tinh khiết được sử dụng làm pha di động khi bắt đầu rửa giải và chạy cho 10 khối lượng (CV). Như được hiển thị trong Hình 3, khi sử dụng nước tinh khiết làm pha di động, mẫu được giữ lại hoàn toàn trên hộp mực flash. Tiếp theo, metanol trong pha di động được tăng trực tiếp lên 100% và độ dốc được duy trì cho 7,5 CV. Mẫu được rửa giải từ 11,5 đến 13,5 cv. Trong các phân số được thu thập, dung dịch mẫu đã được thay thế từ dung dịch đệm NAH2PO4 sang metanol. So sánh với dung dịch nước cao, metanol dễ dàng được loại bỏ bằng cách bay hơi quay trong bước tiếp theo, tạo điều kiện cho các nghiên cứu sau đây.
Hình 3. Sắc ký đồ flash của mẫu trên hộp mực C18AQ.
Để so sánh hành vi lưu giữ của hộp mực C18AQ và hộp mực C18 thông thường cho các mẫu phân cực mạnh, thử nghiệm so sánh song song đã được thực hiện. Một hộp mực flash C18 RP được sử dụng và sắc ký đồ flash cho mẫu được hiển thị trong Hình 4. Đối với các hộp mực C18 thông thường, tỷ lệ pha nước được dung nạp cao nhất là khoảng 90%. Do đó, độ dốc bắt đầu được đặt ở mức 10% metanol trong 90% nước. Như được hiển thị trong Hình 4, do sự sụp đổ pha kỵ nước của các chuỗi C18 gây ra bởi tỷ lệ nước cao, mẫu hầu như không được giữ lại trên hộp mực C18 thông thường và được rửa giải trực tiếp bởi pha di động. Do đó, không thể hoàn thành hoạt động của việc khử muối hoặc tinh chế mẫu.
Hình 4. Sắc ký flash của mẫu trên hộp mực C18 thông thường.
So sánh với gradient tuyến tính, việc sử dụng gradient bước có những lợi thế sau:
1. Sử dụng dung môi và thời gian chạy để tinh chế mẫu bị giảm.
2. Sản phẩm mục tiêu thoát khỏi một đỉnh sắc nét, làm giảm khối lượng các phân số được thu thập và do đó tạo điều kiện cho sự bay hơi quay sau đây cũng như tiết kiệm thời gian.
3. Sản phẩm được thu thập có trong metanol dễ bị bay hơi, do đó thời gian làm khô bị giảm.
Tóm lại, để tinh chế mẫu là các hộp flash flash RP RP mạnh mẽ hoặc ưa nước cao, Sepaflash C18AQ RP Flash kết hợp với máy sắc ký flash chuẩn bị Sepabean ™ có thể cung cấp một giải pháp nhanh chóng và hiệu quả.
Giới thiệu về các hộp mực flash RP liên kết Sepaflash
Có một loạt các hộp mực flash RP Sepaflash C18AQ với các thông số kỹ thuật khác nhau từ công nghệ Santai (như trong Bảng 2).
| Số mục | Kích thước cột | Tốc độ dòng chảy (ml/phút) | Max.Pressure (PSI/BAR) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (aq) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Bảng 2. Hộp flash RP SEPAFLASH C18AQ.
Vật liệu đóng gói: Silica có hiệu quả cao C18 (aq), 20-45 μm, 100.
Logy (như trong Bảng 2).
Thời gian đăng: Tháng 8-27-2018