Hongcheng Wang, Bo Xu
Trung tâm R&D ứng dụng
Giới thiệu
Theo sự phân cực tương đối của pha tĩnh và pha động, sắc ký lỏng có thể được chia thành sắc ký pha thường (NPC) và sắc ký pha đảo (RPC).Đối với RPC, độ phân cực của pha động mạnh hơn so với pha tĩnh.RPC đã trở thành loại được sử dụng rộng rãi nhất trong các chế độ tách sắc ký lỏng do hiệu quả cao, độ phân giải tốt và cơ chế lưu giữ rõ ràng.Do đó, RPC phù hợp để tách và tinh chế các hợp chất phân cực hoặc không phân cực khác nhau, bao gồm alkaloid, carbohydrate, axit béo, steroid, axit nucleic, axit amin, peptide, protein, v.v. Trong RPC, pha tĩnh được sử dụng phổ biến nhất là ma trận silica gel được liên kết với các nhóm chức năng khác nhau, bao gồm C18, C8, C4, phenyl, cyano, amino, v.v. Trong số các nhóm chức năng được liên kết này, nhóm được sử dụng rộng rãi nhất là C18.Người ta ước tính rằng hơn 80% RPC hiện đang sử dụng pha liên kết C18.Do đó cột sắc ký C18 đã trở thành cột vạn năng cần phải có của mọi phòng thí nghiệm.
Mặc dù cột C18 có thể được sử dụng trong rất nhiều ứng dụng, tuy nhiên, đối với một số mẫu rất phân cực hoặc ưa nước cao, các cột C18 thông thường có thể gặp vấn đề khi được sử dụng để tinh chế các mẫu đó.Trong RPC, các dung môi rửa giải thường được sử dụng có thể được sắp xếp theo độ phân cực của chúng: nước < metanol < acetonitril < etanol < tetrahydrofuran < isopropanol.Để đảm bảo lưu giữ tốt trên cột đối với các mẫu này (phân cực mạnh hoặc ưa nước cao), tỷ lệ cao của hệ nước là cần thiết để sử dụng làm pha động.Tuy nhiên, khi sử dụng hệ thống nước tinh khiết (bao gồm nước tinh khiết hoặc dung dịch muối tinh khiết) làm pha động, chuỗi carbon dài trên pha tĩnh của cột C18 có xu hướng tránh nước và trộn lẫn với nhau, dẫn đến sự sụt giảm tức thời trong khả năng lưu giữ của cột hoặc thậm chí không lưu giữ.Hiện tượng này được gọi là “sụp đổ pha kỵ nước” (như thể hiện trong phần bên trái của Hình 1).Mặc dù tình trạng này có thể đảo ngược khi cột được rửa bằng dung môi hữu cơ như metanol hoặc axetonitril, nhưng nó vẫn có thể gây hư hỏng cho cột.Vì vậy, cần phải ngăn chặn tình trạng này xảy ra.
Hình 1. Giản đồ của các pha liên kết trên bề mặt silica gel trong cột C18 thông thường (trái) và cột C18AQ (phải).
Để giải quyết các vấn đề nêu trên, các nhà sản xuất vật liệu đóng gói sắc ký đã có những cải tiến kỹ thuật.Một trong những cải tiến này là thực hiện một số sửa đổi trên bề mặt của ma trận silica, chẳng hạn như đưa vào các nhóm cyano ưa nước (như thể hiện ở phần bên phải của Hình 1), để làm cho bề mặt của silica gel ưa nước hơn.Do đó, các chuỗi C18 trên bề mặt silica có thể được mở rộng hoàn toàn trong điều kiện có nhiều nước và có thể tránh được sự sụp đổ của pha kỵ nước.Các cột C18 biến đổi này được gọi là các cột C18 có nước, cụ thể là các cột C18AQ, được thiết kế cho các điều kiện rửa giải có nhiều nước và có thể chịu được hệ thống 100% có nước.Cột C18AQ đã được ứng dụng rộng rãi trong việc tách và tinh chế các hợp chất phân cực mạnh, bao gồm axit hữu cơ, peptide, nucleoside và vitamin tan trong nước.
Khử muối là một trong những ứng dụng điển hình của cột C18AQ trong quá trình tinh chế nhanh mẫu, giúp loại bỏ muối hoặc thành phần đệm trong dung môi mẫu để thuận lợi cho việc ứng dụng mẫu trong các nghiên cứu tiếp theo.Trong bài đăng này, Brilliant Blue FCF có độ phân cực mạnh đã được sử dụng làm mẫu và tinh chế trên cột C18AQ.Dung môi mẫu được thay thế bằng dung môi hữu cơ từ dung dịch đệm nên tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình bay hơi quay sau cũng như tiết kiệm dung môi và thời gian vận hành.Hơn nữa, độ tinh khiết của mẫu được cải thiện bằng cách loại bỏ một số tạp chất trong mẫu.
Phần thực nghiệm
Hình 2. Cấu trúc hóa học của mẫu.
Brilliant Blue FCF đã được sử dụng làm mẫu trong bài viết này.Độ tinh khiết của mẫu thô là 86% và cấu trúc hóa học của mẫu được thể hiện trong Hình 2. Để chuẩn bị dung dịch mẫu, 300 mg chất rắn thô dạng bột của Brilliant Blue FCF được hòa tan trong dung dịch đệm NaH2PO4 1 M và lắc kỹ để trở thành một giải pháp hoàn toàn rõ ràng.Sau đó, dung dịch mẫu được tiêm vào cột flash bằng kim phun.Thiết lập thử nghiệm của thanh lọc flash được liệt kê trong Bảng 1.
| Dụng cụ | Máy SepaBean™2 | |||
| hộp mực | Hộp đèn flash 12 g SepaFlash C18 RP (silica hình cầu, 20 - 45 μm, 100 Å, Số đặt hàng: SW-5222-012-SP) | Hộp đèn flash 12 g SepaFlash C18AQ RP (silica hình cầu, 20 - 45 μm, 100 Å, Số đặt hàng：SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| bước sóng | 254nm | |||
| Pha động | Dung môi A：Nước Dung môi B：Metanol | |||
| Lưu lượng dòng chảy | 30 mL/phút | |||
| tải mẫu | 300 mg (Brilliant Blue FCF với độ tinh khiết 86%) | |||
| Dốc | Thời gian (CV) | Dung môi B (%) | Thời gian (CV) | Dung môi B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17,5 | 100 | 17,5 | 100 | |
| 17,6 | 10 | 17,6 | 0 | |
| 22,6 | 10 | 22,6 | 0 | |
Kết quả và thảo luận
Hộp flash SepaFlash C18AQ RP được sử dụng để khử muối và tinh chế mẫu.Bước gradient được sử dụng trong đó nước tinh khiết được sử dụng làm pha động khi bắt đầu rửa giải và chạy trong 10 thể tích cột (CV).Như thể hiện trong Hình 3, khi sử dụng nước tinh khiết làm pha động, mẫu được giữ lại hoàn toàn trên cột nhanh.Tiếp theo, metanol trong pha động được tăng trực tiếp lên 100% và độ dốc được duy trì trong 7,5 CV.Mẫu được rửa giải từ 11,5 đến 13,5 CV.Trong các phần thu được, dung dịch mẫu được thay thế từ dung dịch đệm NaH2PO4 thành metanol.So với dung dịch có nồng độ nước cao, metanol được loại bỏ dễ dàng hơn nhiều bằng cách cho bay hơi quay trong bước tiếp theo, điều này tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3. Sắc ký đồ nhanh của mẫu trên cột C18AQ.
Để so sánh hoạt động lưu giữ của hộp mực C18AQ và hộp mực C18 thông thường đối với các mẫu có tính phân cực mạnh, thử nghiệm so sánh song song đã được thực hiện.Hộp flash SepaFlash C18 RP đã được sử dụng và sắc ký đồ flash của mẫu được thể hiện trong Hình 4. Đối với hộp flash C18 thông thường, tỷ lệ pha nước dung nạp cao nhất là khoảng 90%.Do đó, gradient bắt đầu được đặt ở 10% metanol trong 90% nước.Như thể hiện trong Hình 4, do sự sụp đổ pha kỵ nước của chuỗi C18 gây ra bởi tỷ lệ nước cao, mẫu hầu như không được giữ lại trên hộp C18 thông thường và được rửa giải trực tiếp bằng pha động.Do đó, không thể hoàn thành thao tác khử muối hoặc tinh chế mẫu.
Hình 4. Sắc ký đồ nhanh của mẫu trên hộp C18 thông thường.
So với gradient tuyến tính, việc sử dụng gradient bước có những ưu điểm sau:
1. Việc sử dụng dung môi và thời gian chạy để tinh chế mẫu giảm.
2. Sản phẩm mục tiêu rửa giải có pic sắc nét, làm giảm thể tích của các phần thu được và do đó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cô quay sau đó cũng như tiết kiệm thời gian.
3. Sản phẩm thu được ở dạng metanol dễ bay hơi nên thời gian sấy giảm.
Tóm lại, để tinh chế mẫu phân cực mạnh hoặc ưa nước cao, hộp sắc ký nhanh SepaFlash C18AQ RP kết hợp với hệ thống sắc ký nhanh chuẩn bị SepaBean™ Machine có thể mang lại giải pháp nhanh chóng và hiệu quả.
Giới thiệu về hộp flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Có một loạt hộp flash SepaFlash C18AQ RP với các thông số kỹ thuật khác nhau từ Santai Technology (như trong Bảng 2).
| Số mặt hàng | Kích thước cột | Lưu lượng dòng chảy (mL/phút) | Áp lực tối đa (psi/thanh) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 gam | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 gam | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 gam | 40-80 | 250/17.2 |
Bảng 2. Hộp đèn flash SepaFlash C18AQ RP.
Vật liệu đóng gói: Silica liên kết C18(AQ) hình cầu hiệu suất cao, 20 - 45 μm, 100 Å.
logic (như thể hiện trong Bảng 2).
Thời gian đăng: 27-Aug-2018