Xongcheng Vang, Bo Xu
Ilova ilmiy-tadqiqot markazi
Kirish
Statsionar faza va mobil fazaning nisbiy qutblariga ko'ra, suyuq xromatografiya oddiy fazali xromatografiya (NPC) va teskari fazali xromatografiya (RPC) ga bo'linishi mumkin.RPC uchun mobil fazaning polaritesi statsionar fazaga qaraganda kuchliroqdir.RPC o'zining yuqori samaradorligi, yaxshi piksellar sonini va aniq ushlab turish mexanizmi tufayli suyuq xromatografiyani ajratish rejimlarida eng ko'p qo'llaniladigan moddaga aylandi.Shuning uchun RPC turli xil qutbli yoki qutbsiz birikmalarni, jumladan alkaloidlar, uglevodlar, yog 'kislotalari, steroidlar, nuklein kislotalar, aminokislotalar, peptidlar, oqsillarni va boshqalarni ajratish va tozalash uchun javob beradi. RPCda eng ko'p ishlatiladigan statsionar faza hisoblanadi. turli funktsional guruhlar, jumladan C18, C8, C4, fenil, siyano, aminokislotalar va boshqalar bilan bog'langan silika gel matritsasi. Ushbu bog'langan funktsional guruhlar orasida eng ko'p qo'llaniladigan C18 hisoblanadi.Hisob-kitoblarga ko'ra, RPC ning 80% dan ortig'i hozirda C18 bog'langan fazadan foydalanmoqda.Shuning uchun C18 xromatografiya ustuni har bir laboratoriya uchun universal ustunga aylandi.
C18 ustuni juda keng doiradagi ilovalarda qo'llanilishi mumkin bo'lsa-da, lekin juda qutbli yoki yuqori hidrofilik bo'lgan ba'zi namunalar uchun oddiy C18 ustunlari bunday namunalarni tozalash uchun foydalanilganda muammolarga duch kelishi mumkin.RPCda tez-tez ishlatiladigan elutsiya erituvchilarni ularning qutblariga qarab tartiblash mumkin: suv < metanol < asetonitril < etanol < tetrahidrofuran < izopropanol.Ushbu namunalar uchun (kuchli qutbli yoki yuqori hidrofilik) ustunda yaxshi saqlanishini ta'minlash uchun suvli tizimning yuqori ulushi mobil faza sifatida ishlatilishi kerak.Biroq, toza suv tizimidan (shu jumladan toza suv yoki toza tuz eritmasi) mobil faza sifatida foydalanilganda, C18 ustunining statsionar fazasidagi uzun uglerod zanjiri suvdan qochishga va bir-biri bilan aralashishga intiladi, bu esa bir zumda pasayishiga olib keladi. ustunning ushlab turish qobiliyati yoki hatto ushlab turishning yo'qligi.Ushbu hodisa "hidrofobik fazaning qulashi" deb ataladi (1-rasmning chap qismida ko'rsatilganidek).Kolonna metanol yoki asetonitril kabi organik erituvchilar bilan yuvilganda bu holat qaytarilsa ham, u baribir ustunga zarar etkazishi mumkin.Shuning uchun bu holat yuzaga kelishining oldini olish kerak.
Shakl 1. Oddiy C18 ustunida (chapda) va C18AQ ustunida (o'ngda) silikagel yuzasida bog'langan fazalarning sxematik diagrammasi.
Yuqorida aytib o'tilgan muammolarni hal qilish uchun xromatografik qadoqlash materiallari ishlab chiqaruvchilari texnik yaxshilanishlarni amalga oshirdilar.Ushbu yaxshilanishlardan biri silika matritsasining yuzasida ba'zi o'zgarishlarni amalga oshirishdir, masalan, gidrofil siyano guruhlarini kiritish (1-rasmning o'ng qismida ko'rsatilganidek), silika jelining sirtini yanada hidrofil qilish.Shunday qilib, silika yuzasidagi C18 zanjirlari yuqori suvli sharoitlarda to'liq kengaytirilishi va hidrofobik fazaning qulashi oldini olish mumkin edi.Ushbu o'zgartirilgan C18 ustunlari suvli C18 ustunlari, ya'ni C18AQ ustunlari deb ataladi, ular yuqori suvli elutsiya sharoitlari uchun mo'ljallangan va 100% suvli tizimga bardosh bera oladi.C18AQ ustunlari kuchli qutbli birikmalarni, shu jumladan organik kislotalar, peptidlar, nukleozidlar va suvda eriydigan vitaminlarni ajratish va tozalashda keng qo'llaniladi.
Tuzsizlantirish C18AQ ustunlarining namunalar uchun chaqqon tozalashda odatiy qo'llanilishidan biri bo'lib, keyingi tadqiqotlarda namunani qo'llashni osonlashtirish uchun namunadagi erituvchi tarkibidagi tuz yoki bufer komponentlarini olib tashlaydi.Ushbu postda kuchli qutbli Brilliant Blue FCF namuna sifatida ishlatilgan va C18AQ ustunida tozalangan.Namuna solventi bufer eritmasidan organik erituvchi bilan almashtirildi, bu esa quyidagi aylanuvchi bug'lanishni osonlashtirdi, shuningdek, erituvchilar va ish vaqtini tejaydi.Bundan tashqari, namunadagi ba'zi aralashmalarni olib tashlash orqali namunaning tozaligi yaxshilandi.
Eksperimental bo'lim
Shakl 2. Namunaning kimyoviy tuzilishi.
Brilliant Blue FCF ushbu postda namuna sifatida ishlatilgan.Xom namunaning tozaligi 86% ni tashkil etdi va namunaning kimyoviy tuzilishi 2-rasmda ko'rsatilgan. Namuna eritmasini tayyorlash uchun Brilliant Blue FCF ning 300 mg kukunli xom qattiqligi 1 M NaH2PO4 bufer eritmasida eritildi va yaxshilab silkitildi. butunlay aniq yechim.Namuna eritmasi keyin injektor orqali flesh ustunga AOK qilindi.Fleshli tozalashning eksperimental o'rnatilishi 1-jadvalda keltirilgan.
| Asbob | SepaBean™ mashinasi2 | |||
| Patronlar | 12 g SepaFlash C18 RP flesh-kartriji (sferik kremniy oksidi, 20 - 45 mkm, 100 Å, Buyurtma raqami: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flesh-kartriji (sferik kremniy oksidi, 20 - 45 mkm, 100 Å, Buyurtma raqami: SW-5222-012-SP(AQ))) | ||
| To'lqin uzunligi | 254 nm | |||
| Mobil bosqich | Erituvchi A: Suv Solvent B: metanol | |||
| Oqim darajasi | 30 ml/min | |||
| Namuna yuklash | 300 mg (tozaligi 86% bo'lgan Brilliant Blue FCF) | |||
| Gradient | Vaqt (CV) | Solvent B (%) | Vaqt (CV) | Solvent B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Natijalar va muhokama
Namunani tuzsizlantirish va tozalash uchun SepaFlash C18AQ RP flesh-kartri ishlatilgan.Bosqich gradienti qo'llanildi, bunda toza suv elutsiya boshida mobil faza sifatida ishlatilgan va 10 ta ustun hajmi (CV) uchun ishlaydi.3-rasmda ko'rsatilganidek, toza suvdan mobil faza sifatida foydalanilganda, namuna to'liq flesh kartrijda saqlanib qolgan.Keyinchalik, mobil fazadagi metanol to'g'ridan-to'g'ri 100% ga oshirildi va gradient 7,5 CV uchun saqlanib qoldi.Namuna 11,5 dan 13,5 CV gacha elutsiya qilingan.Yig'ilgan fraktsiyalarda namuna eritmasi NaH2PO4 bufer eritmasidan metanolga almashtirildi.Yuqori suvli eritma bilan solishtirganda, metanolni keyingi bosqichda aylanma bug'lanish orqali olib tashlash ancha oson edi, bu esa keyingi tadqiqotlarni osonlashtiradi.
Shakl 3. C18AQ kartrijidagi namunaning flesh-xromatogrammasi.
Kuchli qutblilik namunalari uchun C18AQ kartriji va oddiy C18 kartridjining ushlab turish xatti-harakatlarini solishtirish uchun parallel taqqoslash testi o'tkazildi.SepaFlash C18 RP flesh-kartrijidan foydalanilgan va namuna uchun flesh-xromatogramma 4-rasmda ko'rsatilgan. Oddiy C18 kartridjlari uchun eng yuqori bardoshli suvli faza nisbati taxminan 90% ni tashkil qiladi.Shuning uchun boshlang'ich gradient 90% suvda 10% metanolga o'rnatildi.4-rasmda ko'rsatilganidek, yuqori suvli nisbatdan kelib chiqqan C18 zanjirlarining hidrofobik fazasining qulashi tufayli namuna oddiy C18 kartridjida zo'rg'a saqlanib qoldi va to'g'ridan-to'g'ri mobil faza bilan elutsiya qilindi.Natijada, namunani tuzsizlantirish yoki tozalash jarayonini yakunlab bo'lmaydi.
Shakl 4. Oddiy C18 kartrijdagi namunaning flesh-xromatogrammasi.
Chiziqli gradient bilan solishtirganda, qadam gradientidan foydalanish quyidagi afzalliklarga ega:
1. Solventdan foydalanish va namunani tozalash uchun ishlash muddati kamayadi.
2. Maqsadli mahsulot o'tkir cho'qqisida elutes bo'lib, bu yig'ilgan fraktsiyalar hajmini kamaytiradi va shu tariqa keyingi aylanma bug'lanishni osonlashtiradi, shuningdek vaqtni tejaydi.
3. Yig'ilgan mahsulot metanolda bo'lib, bug'lanishi oson, shuning uchun quritish vaqti kamayadi.
Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, kuchli qutbli yoki yuqori darajada gidrofil bo'lgan namunani tozalash uchun SepaFlash C18AQ RP flesh-kartrijlari SepaBean™ Machine preparativ flesh-xromatografiya tizimi bilan birgalikda tez va samarali yechim taklif qilishi mumkin.
SepaFlash Bonded Series C18 RP flesh-kartrijlari haqida
SepaFlash C18AQ RP flesh-kartrijlari qatori Santai Technology-dan farqli xususiyatlarga ega (2-jadvalda ko'rsatilganidek).
| Element raqami | Ustun o'lchami | Oqim darajasi (ml/min) | Maksimal bosim (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 gr | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 gr | 40-80 | 250/17.2 |
Jadval 2. SepaFlash C18AQ RP flesh-kartrijlari.
Qadoqlash materiallari: Yuqori samarali sferik C18(AQ) bilan bog'langan kremniy oksidi, 20 - 45 mkm, 100 Å.
logiya (2-jadvalda ko'rsatilganidek).
Yuborilgan vaqt: 27-avgust, 2018-yil