ہونگ چینگ وانگ، بو سو
درخواست آر اینڈ ڈی سینٹر
تعارف
سٹیشنری فیز اور موبائل فیز کی متعلقہ پولرٹیز کے مطابق، مائع کرومیٹوگرافی کو نارمل فیز کرومیٹوگرافی (NPC) اور ریورس فیز کرومیٹوگرافی (RPC) میں تقسیم کیا جا سکتا ہے۔RPC کے لیے، موبائل فیز کی قطبیت اسٹیشنری فیز سے زیادہ مضبوط ہے۔RPC اپنی اعلی کارکردگی، اچھی ریزولوشن اور واضح برقرار رکھنے کے طریقہ کار کی وجہ سے مائع کرومیٹوگرافی علیحدگی کے طریقوں میں سب سے زیادہ استعمال ہونے والا بن گیا ہے۔لہذا آر پی سی مختلف قطبی یا غیر قطبی مرکبات کی علیحدگی اور تطہیر کے لیے موزوں ہے جن میں الکلائیڈز، کاربوہائیڈریٹس، فیٹی ایسڈز، سٹیرائیڈز، نیوکلک ایسڈز، امینو ایسڈز، پیپٹائڈس، پروٹین وغیرہ شامل ہیں۔ سلیکا جیل میٹرکس جو مختلف فنکشنل گروپس کے ساتھ بندھا ہوا ہے، بشمول C18، C8، C4، فینائل، سائانو، امینو، وغیرہ۔ ان بانڈڈ فنکشنل گروپس میں سب سے زیادہ استعمال ہونے والا C18 ہے۔ایک اندازے کے مطابق 80% سے زیادہ RPC اب C18 بانڈڈ فیز استعمال کر رہے ہیں۔اس لیے C18 کرومیٹوگرافی کالم ہر لیبارٹری کے لیے لازمی یونیورسل کالم بن گیا ہے۔
اگرچہ C18 کالم ایپلی کیشنز کی ایک بہت وسیع رینج میں استعمال کیا جا سکتا ہے، تاہم، کچھ نمونوں کے لیے جو بہت قطبی یا انتہائی ہائیڈرو فیلک ہیں، ایسے نمونوں کو صاف کرنے کے لیے استعمال ہونے پر باقاعدہ C18 کالموں میں دشواری ہو سکتی ہے۔آر پی سی میں، عام طور پر استعمال ہونے والے ایلوشن سالوینٹس کو ان کی قطبیت کے مطابق آرڈر کیا جا سکتا ہے: پانی < میتھانول < ایسٹونیٹریل < ایتھنول < ٹیٹراہائیڈروفورن < آئسوپروپانول۔ان نمونوں (مضبوط قطبی یا انتہائی ہائیڈرو فیلک) کے کالم پر اچھی برقراری کو یقینی بنانے کے لیے، آبی نظام کے اعلی تناسب کو موبائل مرحلے کے طور پر استعمال کرنا ضروری ہے۔تاہم، جب خالص پانی کے نظام (بشمول خالص پانی یا خالص نمک کے محلول) کو موبائل فیز کے طور پر استعمال کرتے ہیں، C18 کالم کے اسٹیشنری فیز پر کاربن کی لمبی زنجیر پانی سے بچنے اور ایک دوسرے کے ساتھ گھل مل جاتی ہے، جس کے نتیجے میں فوری طور پر کمی واقع ہوتی ہے۔ کالم کی برقرار رکھنے کی صلاحیت یا یہاں تک کہ کوئی برقراری نہیں۔اس رجحان کو "ہائیڈروفوبک مرحلے کا خاتمہ" کہا جاتا ہے (جیسا کہ شکل 1 کے بائیں حصے میں دکھایا گیا ہے)۔اگرچہ کالم کو نامیاتی سالوینٹس جیسے میتھانول یا ایسٹونائٹرائل سے دھونے پر یہ صورتحال الٹ سکتی ہے، پھر بھی یہ کالم کو نقصان پہنچا سکتی ہے۔اس لیے اس صورت حال کو ہونے سے روکنا ضروری ہے۔
شکل 1. باقاعدہ C18 کالم (بائیں) اور C18AQ کالم (دائیں) میں سیلیکا جیل کی سطح پر بانڈڈ مراحل کا اسکیمیٹک خاکہ۔
مذکورہ بالا مسائل کو حل کرنے کے لیے، کرومیٹوگرافک پیکنگ میٹریل مینوفیکچررز نے تکنیکی بہتری کی ہے۔ان میں سے ایک بہتری سلکا میٹرکس کی سطح پر کچھ تبدیلیاں کرنا ہے، جیسے کہ ہائیڈرو فیلک سائانو گروپس کا تعارف (جیسا کہ شکل 1 کے دائیں حصے میں دکھایا گیا ہے)، تاکہ سلیکا جیل کی سطح کو مزید ہائیڈرو فیلک بنایا جاسکے۔اس طرح سیلیکا کی سطح پر C18 زنجیروں کو انتہائی پانی والے حالات میں مکمل طور پر بڑھایا جا سکتا ہے اور ہائیڈروفوبک مرحلے کے خاتمے سے بچا جا سکتا ہے۔ان ترمیم شدہ C18 کالموں کو آبی C18 کالم کہا جاتا ہے، یعنی C18AQ کالم، جو انتہائی آبی اخراج کے حالات کے لیے ڈیزائن کیے گئے ہیں اور 100% آبی نظام کو برداشت کر سکتے ہیں۔C18AQ کالموں کو مضبوط قطبی مرکبات کی علیحدگی اور صاف کرنے میں بڑے پیمانے پر لاگو کیا گیا ہے، بشمول نامیاتی تیزاب، پیپٹائڈس، نیوکلیوسائیڈز اور پانی میں گھلنشیل وٹامنز۔
ڈیسالٹنگ نمونوں کے لیے فلیش پیوریفیکیشن میں C18AQ کالموں کی مخصوص ایپلی کیشنز میں سے ایک ہے، جو نمونے کے سالوینٹ میں نمک یا بفر کے اجزاء کو ہٹاتا ہے تاکہ بعد کے مطالعے میں نمونے کے اطلاق میں آسانی ہو۔اس پوسٹ میں، مضبوط قطبیت کے ساتھ شاندار بلیو ایف سی ایف کو نمونے کے طور پر استعمال کیا گیا اور C18AQ کالم پر صاف کیا گیا۔نمونہ سالوینٹس کو بفر محلول سے نامیاتی سالوینٹ سے بدل دیا گیا، اس طرح مندرجہ ذیل روٹری بخارات کے ساتھ ساتھ سالوینٹس اور آپریٹنگ وقت کی بچت بھی ہوئی۔مزید برآں، نمونے میں موجود کچھ نجاستوں کو ہٹا کر نمونے کی پاکیزگی کو بہتر بنایا گیا۔
تجرباتی جگہ
شکل 2۔ نمونے کی کیمیائی ساخت۔
اس پوسٹ میں شاندار بلیو ایف سی ایف کو بطور نمونہ استعمال کیا گیا تھا۔خام نمونے کی پاکیزگی 86% تھی اور نمونے کی کیمیائی ساخت کو شکل 2 میں دکھایا گیا تھا۔ نمونے کے محلول کو تیار کرنے کے لیے، 300 ملی گرام پاؤڈری خام سالڈ برلیئنٹ بلیو ایف سی ایف کو 1 M NaH2PO4 بفر محلول میں تحلیل کیا گیا اور اچھی طرح ہلایا گیا ایک مکمل طور پر واضح حل.نمونے کے حل کو پھر ایک انجیکٹر کے ذریعہ فلیش کالم میں انجکشن کیا گیا۔فلیش پیوریفیکیشن کا تجرباتی سیٹ اپ ٹیبل 1 میں درج ہے۔
| آلہ | SepaBean™ مشین2 | |||
| کارتوس | 12 جی SepaFlash C18 RP فلیش کارتوس (کروی سلکا، 20 - 45 μm، 100 Å، آرڈر نمبر: SW-5222-012-SP) | 12 جی SepaFlash C18AQ RP فلیش کارتوس (کروی سیلیکا، 20 - 45 μm، 100 Å، آرڈر نمبر：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| طول موج | 254 این ایم | |||
| موبائل مرحلہ | سالوینٹ A: پانی سالوینٹ بی: میتھانول | |||
| بہاؤ کی شرح | 30 ملی لیٹر/منٹ | |||
| نمونہ لوڈ ہو رہا ہے۔ | 300 ملی گرام (86% کی پاکیزگی کے ساتھ شاندار بلیو ایف سی ایف) | |||
| میلان | وقت (CV) | سالوینٹ B (%) | وقت (CV) | سالوینٹ B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
نتائج اور مباحثہ
ایک SepaFlash C18AQ RP فلیش کارتوس نمونے کو صاف کرنے اور صاف کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔اسٹیپ گریڈینٹ کا استعمال کیا گیا جس میں خالص پانی کو موبائل فیز کے طور پر ایلیوشن کے آغاز میں استعمال کیا گیا اور 10 کالم والیوم (CV) کے لیے چلایا گیا۔جیسا کہ شکل 3 میں دکھایا گیا ہے، جب موبائل مرحلے کے طور پر خالص پانی کا استعمال کرتے ہوئے، نمونہ مکمل طور پر فلیش کارتوس پر برقرار رکھا گیا تھا۔اس کے بعد، موبائل مرحلے میں میتھانول کو براہ راست 100٪ تک بڑھا دیا گیا اور 7.5 CV کے لیے گریڈینٹ کو برقرار رکھا گیا۔نمونے کو 11.5 سے 13.5 CV تک نکال دیا گیا تھا۔جمع شدہ حصوں میں، نمونے کے حل کو NaH2PO4 بفر حل سے میتھانول میں تبدیل کیا گیا تھا۔انتہائی آبی محلول کے ساتھ موازنہ کرتے ہوئے، اگلے مرحلے میں روٹری بخارات کے ذریعے میتھانول کو ہٹانا بہت آسان تھا، جو درج ذیل تحقیق کو سہولت فراہم کرتا ہے۔
شکل 3۔ C18AQ کارتوس پر نمونے کا فلیش کرومیٹوگرام۔
مضبوط قطبیت کے نمونوں کے لیے C18AQ کارتوس اور باقاعدہ C18 کارتوس کے برقرار رکھنے کے رویے کا موازنہ کرنے کے لیے، متوازی موازنہ ٹیسٹ کیا گیا۔ایک SepaFlash C18 RP فلیش کارتوس استعمال کیا گیا تھا اور نمونے کے لیے فلیش کرومیٹوگرام کو شکل 4 میں دکھایا گیا تھا۔ باقاعدہ C18 کارتوس کے لیے، سب سے زیادہ برداشت شدہ پانی کے مرحلے کا تناسب تقریباً 90% ہے۔اس لیے سٹارٹ گریڈینٹ 90% پانی میں 10% میتھانول پر سیٹ کیا گیا تھا۔جیسا کہ شکل 4 میں دکھایا گیا ہے، اعلی آبی تناسب کی وجہ سے C18 زنجیروں کے ہائیڈروفوبک مرحلے کے خاتمے کی وجہ سے، نمونہ بمشکل باقاعدہ C18 کارتوس پر برقرار رکھا گیا تھا اور موبائل مرحلے کے ذریعہ براہ راست خارج کردیا گیا تھا۔نتیجتاً، نمونے کو صاف کرنے یا صاف کرنے کا عمل مکمل نہیں کیا جا سکتا۔
شکل 4. باقاعدہ C18 کارتوس پر نمونے کا فلیش کرومیٹوگرام۔
لکیری میلان کے ساتھ موازنہ کرتے ہوئے، مرحلہ میلان کے استعمال کے درج ذیل فوائد ہیں:
1. سالوینٹ کا استعمال اور نمونہ صاف کرنے کا وقت کم ہو گیا ہے۔
2. ٹارگٹ پروڈکٹ ایک تیز چوٹی پر نکلتا ہے، جو جمع شدہ حصوں کی مقدار کو کم کرتا ہے اور اس طرح مندرجہ ذیل روٹری بخارات کے ساتھ ساتھ وقت کی بچت میں بھی سہولت فراہم کرتا ہے۔
3. جمع شدہ پراڈکٹ میتھانول میں ہوتی ہے جس کا بخارات بننا آسان ہوتا ہے، اس طرح خشک ہونے کا وقت کم ہوجاتا ہے۔
آخر میں، قطبی یا انتہائی ہائیڈرو فیلک نمونے کو صاف کرنے کے لیے، SepaFlash C18AQ RP فلیش کارتوس تیاری کے فلیش کرومیٹوگرافی سسٹم SepaBean™ مشین کے ساتھ مل کر ایک تیز اور موثر حل پیش کر سکتا ہے۔
SepaFlash بانڈڈ سیریز C18 RP فلیش کارتوس کے بارے میں
سانٹائی ٹیکنالوجی کی مختلف خصوصیات کے ساتھ SepaFlash C18AQ RP فلیش کارتوس کی ایک سیریز ہے (جیسا کہ جدول 2 میں دکھایا گیا ہے)۔
| آئٹم نمبر | کالم کا سائز | بہاؤ کی شرح (mL/منٹ) | زیادہ سے زیادہ دباؤ (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 جی | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 گرام | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 گرام | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 گرام | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 گرام | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 گرام | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 گرام | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 گرام | 40-80 | 250/17.2 |
ٹیبل 2. SepaFlash C18AQ RP فلیش کارتوس۔
پیکنگ مواد: اعلی کارکردگی کا کروی C18 (AQ) بانڈڈ سلکا، 20 - 45 μm، 100 Å۔
logy (جیسا کہ جدول 2 میں دکھایا گیا ہے)۔
پوسٹ ٹائم: اگست 27-2018