Руй Хуан, Бо Сюй
Дослідницький центр застосування
вступ
Пептид — це сполука, що складається з амінокислот, кожна з яких має унікальні фізичні та хімічні властивості завдяки різним типам і порядку амінокислотних залишків, що утворюють її послідовність.З розвитком твердофазного хімічного синтезу хімічний синтез різних активних пептидів досяг значного прогресу.Однак через складний склад пептиду, отриманого твердофазним синтезом, кінцевий продукт слід очищати надійними методами розділення.Зазвичай використовувані методи очищення пептидів включають іонообмінну хроматографію (IEC) і обернено-фазову високоефективну рідинну хроматографію (RP-HPLC), які мають недоліки: низька ємність завантаження зразка, висока вартість середовища для розділення, складне та дороге обладнання для розділення, тощо. Для швидкого очищення маломолекулярних пептидів (молекулярна вага < 1 кДа) компанія Santai Technologies раніше опублікувала успішне застосування, у якому картридж SepaFlash RP C18 використовувався для швидкого очищення тимопентину (TP-5) і отримано цільовий продукт, що відповідає вимогам.
Малюнок 1. 20 поширених амінокислот (відтворено з www.bachem.com).
До складу пептидів входять 20 видів амінокислот.Ці амінокислоти можна розділити на такі групи відповідно до їх полярності та кислотно-основних властивостей: неполярні (гідрофобні), полярні (незаряджені), кислотні або основні (як показано на малюнку 1).У пептидній послідовності, якщо амінокислоти, що утворюють послідовність, переважно полярні (як позначено рожевим кольором на малюнку 1), такі як цистеїн, глутамін, аспарагін, серин, треонін, тирозин тощо, тоді цей пептид може мати сильну активність. полярність і бути добре розчинними у воді.Під час процедури очищення цих сильних полярних зразків пептидів за допомогою хроматографії з оберненою фазою відбудеться явище, яке називається гідрофобним колапсом фази (див. раніше опубліковану примітку до заявки Santai Technologies: колапс гідрофобної фази, колонки для хроматографії з оберненою фазою AQ та їх застосування).У порівнянні зі звичайними колонками C18 покращені колонки C18AQ найбільше підходять для очищення сильних полярних або гідрофільних зразків.У цій публікації сильний полярний пептид був використаний як зразок і очищений колонкою C18AQ.В результаті отримано цільовий продукт, який відповідає вимогам і може бути використаний у наступних дослідженнях і розробках.
| Інструмент | SepaBean™машина 2 | |||
| Картриджі | 12 г SepaFlash C18 RP флеш-картридж (сферичний кремнезем, 20–45 мкм, 100 Å, номер замовлення: SW-5222-012-SP) | 12 г SepaFlash C18AQ RP флеш-картридж (сферичний кремнезем, 20–45 мкм, 100 Å, номер замовлення: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Довжина хвилі | 254 нм, 220 нм | 214 нм | ||
| Рухома фаза | Розчинник А: Вода Розчинник B: ацетонітрил | |||
| Швидкість потоку | 15 мл/хв | 20 мл/хв | ||
| Завантаження зразка | 30 мг | |||
| Градієнт | Час (CV) | Розчинник B (%) | Час (хв) | Розчинник B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10,0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20,0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29,0 | 87 | |||
Результати і обговорення
Щоб порівняти ефективність очищення зразка полярного пептиду між звичайною колонкою C18 і колонкою C18AQ, ми використали звичайну колонку C18 для флеш-очищення зразка як початок.Як показано на малюнку 2, через розпад гідрофобної фази ланцюгів C18, викликаний високим водним співвідношенням, зразок ледь утримувався на звичайному картриджі C18 і був безпосередньо елюйований рухомою фазою.У результаті зразок не був ефективно розділений і очищений.
Рисунок 2. Флеш-хроматограма зразка на звичайному картриджі C18.
Далі ми використовували колонку C18AQ для швидкого очищення зразка.Як показано на малюнку 3, пептид ефективно утримувався на колонці, а потім елюювався.Цільовий продукт відокремлювали від домішок у сирому зразку та збирали.Після ліофілізації та аналізу за допомогою ВЕРХ очищений продукт має чистоту 98,2% і може бути використаний для наступних досліджень і розробок.
Рисунок 3. Флеш-хроматограма зразка на картриджі C18AQ.
На завершення, флеш-картридж SepaFlash C18AQ RP у поєднанні з системою флеш-хроматографії SepaBean™машина може запропонувати швидке та ефективне рішення для очищення сильних полярних або гідрофільних зразків.
Існує серія флеш-картриджів SepaFlash C18AQ RP із різними характеристиками від Santai Technology (як показано в таблиці 2).
| Номер позиції | Розмір стовпця | Швидкість потоку (мл/хв) | Максимальний тиск (псі/бар) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 г | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 г | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 г | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 г | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 г | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 г | 40-80 | 250/17,2 |
Таблиця 2. Флеш-картриджі SepaFlash C18AQ RP.Пакувальні матеріали: високоефективний сферичний кремнезем C18(AQ), 20–45 мкм, 100 Å.
Для отримання додаткової інформації щодо детальних специфікацій машини SepaBean™ або інформації про замовлення флеш-картриджів серії SepaFlash відвідайте наш веб-сайт.
Час публікації: 12 жовтня 2018 р