Хунчен Ван, Бо Сюй
Дослідницький центр застосування
вступ
Відповідно до відносної полярності нерухомої фази та рухомої фази рідинну хроматографію можна розділити на нормальнофазову хроматографію (NPC) і хроматографію з оберненою фазою (RPC).Для RPC полярність рухомої фази сильніша, ніж полярність нерухомої фази.RPC став найбільш широко використовуваним у режимах розділення рідинної хроматографії завдяки своїй високій ефективності, гарній роздільній здатності та чіткому механізму утримання.Таким чином, RPC підходить для розділення та очищення різних полярних або неполярних сполук, включаючи алкалоїди, вуглеводи, жирні кислоти, стероїди, нуклеїнові кислоти, амінокислоти, пептиди, білки тощо. У RPC найбільш часто використовуваною стаціонарною фазою є матриця силікагелю, яка пов’язана з різними функціональними групами, включаючи C18, C8, C4, феніл, ціано, аміно тощо. Серед цих зв’язаних функціональних груп найбільш широко використовуваною є C18.За оцінками, більше 80% RPC зараз використовують зв’язану фазу C18.Тому хроматографічна колонка C18 стала обов'язковою універсальною колонкою для кожної лабораторії.
Хоча колонку C18 можна використовувати в дуже широкому діапазоні застосувань, проте для деяких зразків, які є дуже полярними або високогідрофільними, звичайні колонки C18 можуть мати проблеми під час використання для очищення таких зразків.У RPC зазвичай використовувані елююючі розчинники можна впорядкувати відповідно до їх полярності: вода < метанол < ацетонітрил < етанол < тетрагідрофуран < ізопропанол.Щоб забезпечити хороше утримання на колонці для цих зразків (сильних полярних або високогідрофільних), в якості рухомої фази необхідно використовувати велику частку водної системи.Однак при використанні системи з чистою водою (включаючи чисту воду або чистий сольовий розчин) як рухому фазу довгий вуглецевий ланцюг на нерухомій фазі колонки C18 має тенденцію уникати води та змішуватися один з одним, що призводить до миттєвого зниження в утримуюча здатність колони або навіть відсутність утримання.Це явище називається «гідрофобним колапсом фази» (як показано в лівій частині малюнка 1).Хоча ця ситуація є оборотною, коли колонку промивають органічними розчинниками, такими як метанол або ацетонітрил, вона все одно може пошкодити колонку.Тому необхідно не допустити такої ситуації.
Рисунок 1. Схематична діаграма зв’язаних фаз на поверхні силікагелю в звичайній колонці C18 (ліворуч) і колонці C18AQ (праворуч).
Щоб вирішити вищезгадані проблеми, виробники хроматографічних пакувальних матеріалів внесли технічні вдосконалення.Одним із цих удосконалень є внесення деяких модифікацій на поверхню кремнеземної матриці, наприклад введення гідрофільних ціаногруп (як показано в правій частині малюнка 1), щоб зробити поверхню силікагелю більш гідрофільною.Таким чином, ланцюги C18 на поверхні кремнезему можуть бути повністю розширені в умовах високої водності, і можна уникнути колапсу гідрофобної фази.Ці модифіковані колонки C18 називають водними колонками C18, а саме колонками C18AQ, які розроблені для умов висоководного елюювання та можуть переносити 100% водну систему.Колонки C18AQ широко застосовуються для розділення та очищення сильних полярних сполук, включаючи органічні кислоти, пептиди, нуклеозиди та водорозчинні вітаміни.
Знесолення є одним із типових застосувань колонок C18AQ у швидкому очищенні зразків, яке видаляє сіль або буферні компоненти в розчиннику зразка, щоб полегшити застосування зразка в наступних дослідженнях.У цій публікації Brilliant Blue FCF із сильною полярністю використовували як зразок і очищали на колонці C18AQ.Розчинник зразка було замінено органічним розчинником із буферного розчину, що полегшило наступне роторне випаровування, а також заощадило розчинники та час роботи.Крім того, чистота зразка була покращена шляхом видалення деяких домішок у зразку.
Експериментальний відділ
Рисунок 2. Хімічна структура зразка.
Brilliant Blue FCF був використаний як зразок у цій публікації.Чистота необробленого зразка становила 86%, а хімічну структуру зразка показано на малюнку 2. Для приготування розчину зразка 300 мг порошкоподібної сирої твердої речовини Brilliant Blue FCF розчинили в 1 М буферному розчині NaH2PO4 і добре струсили, щоб стати абсолютно чітке рішення.Розчин зразка потім вводили у колонку для швидкого випаровування за допомогою інжектора.Експериментальна установка флеш-очищення наведена в таблиці 1.
| Інструмент | Машина SepaBean™2 | |||
| Картриджі | 12 г SepaFlash C18 RP флеш-картридж (сферичний кремнезем, 20 - 45 мкм, 100 Å, номер замовлення: SW-5222-012-SP) | 12 г SepaFlash C18AQ RP флеш-картридж (сферичний кремнезем, 20–45 мкм, 100 Å, номер замовлення: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Довжина хвилі | 254 нм | |||
| Рухома фаза | Розчинник А: вода Розчинник B: метанол | |||
| Швидкість потоку | 30 мл/хв | |||
| Завантаження зразка | 300 мг (Brilliant Blue FCF чистотою 86%) | |||
| Градієнт | Час (CV) | Розчинник B (%) | Час (CV) | Розчинник B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Результати і обговорення
Для знесолення та очищення зразка використовувався флеш-картридж SepaFlash C18AQ RP.Використовували ступінчастий градієнт, у якому чисту воду використовували як рухому фазу на початку елюювання та проводили для 10 об’ємів колонки (CV).Як показано на малюнку 3, при використанні чистої води як рухомої фази зразок повністю залишався на флеш-картриджі.Потім метанол у рухомій фазі безпосередньо збільшували до 100%, а градієнт підтримували протягом 7,5 CV.Зразок елюювався від 11,5 до 13,5 CV.У зібраних фракціях розчин зразка замінили буферний розчин NaH2PO4 на метанол.Порівняно з висоководним розчином, метанол було набагато легше видалити роторним випаровуванням на наступному етапі, що полегшує наступні дослідження.
Рисунок 3. Флеш-хроматограма зразка на картриджі C18AQ.
Щоб порівняти поведінку утримання картриджа C18AQ і звичайного картриджа C18 для зразків із сильною полярністю, було проведено тест паралельного порівняння.Використовувався флеш-картридж SepaFlash C18 RP, а флеш-хроматограма для зразка показана на малюнку 4. Для звичайних картриджів C18 найвище допустиме співвідношення водної фази становить приблизно 90%.Тому початковий градієнт був встановлений на рівні 10% метанолу в 90% води.Як показано на малюнку 4, через розпад гідрофобної фази ланцюгів C18, викликаний високим водним співвідношенням, зразок майже не утримувався на звичайному картриджі C18 і був безпосередньо елюйований рухомою фазою.У результаті операція знесолення або очищення зразка не може бути завершена.
Малюнок 4. Флеш-хроматограма зразка на звичайному картриджі C18.
У порівнянні з лінійним градієнтом використання ступінчастого градієнта має наступні переваги:
1. Скорочується використання розчинника та час роботи для очищення зразка.
2. Цільовий продукт елююється з різким піком, що зменшує об’єм зібраних фракцій і, таким чином, полегшує наступне роторне випаровування, а також заощаджує час.
3. Зібраний продукт знаходиться в метанолі, який легко випаровується, таким чином скорочується час сушіння.
На закінчення, для очищення зразка, який є сильно полярним або високогідрофільним, флеш-картриджі SepaFlash C18AQ RP у поєднанні з препаративною флеш-хроматографією SepaBean™ Machine можуть запропонувати швидке та ефективне рішення.
Про флеш-картриджі SepaFlash Bonded Series C18 RP
Існує серія флеш-картриджів SepaFlash C18AQ RP із різними характеристиками від Santai Technology (як показано в таблиці 2).
| Номер позиції | Розмір стовпця | Швидкість потоку (мл/хв) | Максимальний тиск (псі/бар) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 г | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 г | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 г | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 г | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 г | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 г | 40-80 | 250/17,2 |
Таблиця 2. Флеш-картриджі SepaFlash C18AQ RP.
Пакувальні матеріали: високоефективний сферичний кремнезем C18(AQ), 20–45 мкм, 100 Å.
логіку (як показано в таблиці 2).
Час публікації: 27 серпня 2018 р