Hongcheng Wang, Bo Xu
Застосування науково -дослідного центру
Вступ
Відповідно до відносних полярностей стаціонарної фази та мобільної фази, рідинна хроматографія може бути поділена на нормальну фазову хроматографію (NPC) та зворотну фазову хроматографію (RPC). Для RPC полярність мобільної фази сильніша, ніж у стаціонарній фазі. RPC став найбільш широко використовуваним у режимах розділення рідинної хроматографії завдяки високій ефективності, хорошій роздільній здатності та чіткому механізму утримання. Тому RPC підходить для розділення та очищення різних полярних або неполярних сполук, включаючи алкалоїди, вуглеводи, жирні кислоти, стероїди, нуклеїнові кислоти, амінокислоти, пептиди, білки тощо. Аміно та ін. Серед цих зв'язаних функціональних груп найбільш широко використовуваним є C18. За підрахунками, більше 80% RPC зараз використовують фазу зв'язку C18. Тому колонка C18 Chromatography стала обов'язковою універсальною колоною для кожної лабораторії.
Хоча стовпчик C18 може бути використаний у дуже широкому діапазоні застосувань, однак для деяких зразків, які є дуже полярними або сильно гідрофільними, регулярні колони C18 можуть мати проблеми при використанні для очищення таких зразків. У RPC часто використовувані розчинники елюції можуть бути упорядковані відповідно до їх полярності: вода <метанол <ацетонітрил <етанол <тетрагідрофуран <ізопропанол. Щоб забезпечити хороше утримання на колонці для цих зразків (сильна полярна або високо гідрофільна), для мобільної фази необхідно висока частка водної системи. Однак, використовуючи систему чистої води (включаючи чисту воду або чисту сольову розчин) як мобільну фазу, довгий вуглецевий ланцюг на стаціонарній фазі колонки С18 має тенденцію уникати води і змішувати між собою, що призводить до миттєвого зменшення утримання потужності колони або навіть не утримання. Це явище називається "гідрофобним колапсом фази" (як показано на лівій частині малюнка 1). Хоча ця ситуація є оборотною, коли стовпчик промивається органічними розчинниками, такими як метанол або ацетонітрил, вона все ще може завдати шкоди стовпчику. Тому необхідно запобігти цій ситуації.
Малюнок 1. Схематична схема скріплених фаз на поверхні силікагелю в звичайній колонці С18 (зліва) та стовпця C18AQ (праворуч).
Для вирішення вищезазначених проблем виробники хроматографічних пакувальних матеріалів зробили технічні вдосконалення. Одним із цих вдосконалень є деякі модифікації на поверхні матриці кремнезему, наприклад, введення гідрофільних ціано -груп (як показано на правій частині фігури 1), щоб зробити поверхню силікагелю більш гідрофільним. Таким чином, ланцюги С18 на поверхні кремнезему можна було б повністю розширитись у високо водних умовах, і можна уникнути руйнування гідрофобної фази. Ці модифіковані стовпці C18 називаються водними стовпцями C18, а саме стовпцями C18AQ, які розроблені для високо водних умов елюції і можуть терпіти 100% водну систему. Стовпці C18AQ широко застосовуються при розділенні та очищенні сильних полярних сполук, включаючи органічні кислоти, пептиди, нуклеозиди та водорозчинні вітаміни.
Дисаль - це одне з типових застосувань стовпців C18AQ у очищенні спалаху для зразків, що видаляє солі або буферні компоненти в розчиннику зразка для полегшення застосування зразка в наступних дослідженнях. У цій публікації геніальний синій FCF з сильною полярністю використовувався в якості зразка та очищено на стовпці C18AQ. Зразок розчинника замінювали органічним розчинником від буферного розчину, таким чином сприяючи наступному поворотному випаровуванню, а також заощаджуючи розчинники та час роботи. Крім того, чистоту зразка поліпшували шляхом видалення деяких домішок у зразку.
Експериментальний розділ
Малюнок 2. Хімічна структура зразка.
Блискучий синій FCF був використаний як зразок у цій публікації. Чистота сирого зразка становила 86%, а хімічна структура зразка була показана на малюнку 2. Для приготування зразка розчину 300 мг порошкоподібного сирого твердого речовини з блискучого синього FCF розчиняли в 1 м NAH2PO4 буферний розчин і добре потрясли, щоб стати повністю чітким розчином. Потім зразок розчину вводили в стовпчик спалаху інжектором. Експериментальна установка очищення спалаху наведена в таблиці 1.
| Інструмент | Машина Sepabean ™2 | |||
| Картридж | 12 г флеш-картриджа Sepaflash C18 RP (сферичний кремнезем, 20-45 мкм, 100 Å, номер замовлення: SW-5222-012-SP) | 12 г флеш-картриджа SEPAFLASH C18AQ RP (сферичний кремнезем, 20-45 мкм, 100 Å, номер замовлення: SW-5222-012 SP (AQ)） | ||
| Довжина хвилі | 254 нм | |||
| Мобільна фаза | Розчинник A: вода Розчинник B: метанол | |||
| Витрата | 30 мл/хв | |||
| Завантаження зразка | 300 мг (блискучий синій FCF з чистотою 86%) | |||
| Градієнт | Час (CV) | Розчинник B (%) | Час (CV) | Розчинник B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Результати та обговорення
Для знесяття та очищення зразка використовували флеш -картридж Sepaflash C18AQ RP. Крок градієнт використовувався, в якому чиста вода використовувалася як мобільна фаза на початку елюції та запускає 10 обсягів стовпців (CV). Як показано на малюнку 3, при використанні чистої води як мобільної фази зразок повністю зберігався на флеш -картриджі. Далі, метанол у мобільній фазі був безпосередньо збільшувався до 100%, а градієнт підтримувався для 7,5 CV. Зразок був елюйований з 11,5 до 13,5 резюме. У зібраних фракціях розчин зразка замінювали від буферного розчину NAH2PO4 на метанол. Порівнюючи з високо водним розчином, метанол було набагато простіше видалити поворотним випаровуванням на наступному етапі, що полегшує наступне дослідження.
Малюнок 3. Спалахна хроматограма зразка на картриджі C18AQ.
Для порівняння поведінки утримання картриджа C18AQ та звичайного картриджа C18 для зразків сильної полярності було проведено паралельне порівняння. Використовували флеш -картридж Sepaflash C18 RP, а спалаха хроматограма для зразка була показана на малюнку 4. Для звичайних картриджів С18 найвищий переноситься водне співвідношення водної фази становить близько 90%. Тому стартовий градієнт був встановлений на рівні 10% метанолу у 90% воді. Як показано на малюнку 4, через колапс гідрофобної фази ланцюгів С18, спричинених високим водним співвідношенням, зразок ледь зберігався на звичайному картриджі С18 і був безпосередньо елюйований мобільною фазою. Як результат, функціонування зразка знесення або очищення не може бути завершена.
Малюнок 4. Спалахна хроматограма зразка на звичайному картриджі C18.
Порівнюючи з лінійним градієнтом, використання етапного градієнта має такі переваги:
1. Використання розчинника та час роботи для очищення зразка скорочується.
2. Цільовий продукт елютував у різкому піку, що зменшує об'єм зібраних фракцій і, таким чином, полегшує наступне поворотне випаровування, а також заощадження часу.
3. Зібраний продукт знаходиться в метанолі, який легко випарувати, таким чином скорочується час сушіння.
На закінчення, для очищення зразка, який сильно полярний або сильно гідрофільний, флеш -картриджі Sepaflash C18AQ RP, що поєднуються з препаративною системою спалаху хроматографії Sepabean ™ Machine, може запропонувати швидке та ефективне рішення.
Про серію C18 RP Sepaflash C18 RP Flash
Існує серія флеш -картриджів Sepaflash C18AQ RP з різними специфікаціями від технології Santai (як показано в таблиці 2).
| Номер товару | Розмір стовпчика | Витрата (мл/хв) | Макс. (PSI/бар) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 г. | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 г | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025 SP (AQ) | 33 г. | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 г. | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 г | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 г. | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 г | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 г | 40-80 | 250/17.2 |
Таблиця 2. Flash -картриджі Sepaflash C18AQ RP.
Пакувальні матеріали: високоефективність сферичного кремнію C18 (AQ), кремнезему, 20-45 мкм, 100 Å.
logy (як показано в таблиці 2).
Час посади: 27-2018 серпня