Rui Huang, Bo Xu
Uygulama Ar-Ge Merkezi
giriiş
Bir peptit, dizisini oluşturan amino asit kalıntılarının farklı türleri ve düzeni nedeniyle her biri benzersiz fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip olan amino asitlerden oluşan bir bileşiktir.Katı faz kimyasal sentezinin gelişmesiyle birlikte çeşitli aktif peptidlerin kimyasal sentezi büyük ilerleme kaydetmiştir.Ancak katı faz senteziyle elde edilen peptidin karmaşık bileşimi nedeniyle nihai ürünün güvenilir ayırma yöntemleriyle saflaştırılması gerekir.Peptitler için yaygın olarak kullanılan saflaştırma yöntemleri arasında, düşük numune yükleme kapasitesi, ayırma ortamının yüksek maliyeti, karmaşık ve maliyetli ayırma ekipmanı gibi dezavantajlara sahip olan iyon değişim kromatografisi (IEC) ve ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) yer alır. vb. Küçük moleküllü peptitlerin (MW < 1 kDa) hızlı saflaştırılması için, Santai Technologies tarafından daha önce başarılı bir uygulama vakası yayınlanmıştı; burada timopentin (TP-5) ve Gereksinimleri karşılayan hedef ürün elde edildi.
Şekil 1. 20 yaygın amino asit (www.bachem.com'dan alınmıştır).
Peptitlerin bileşiminde yaygın olarak bulunan 20 çeşit amino asit vardır.Bu amino asitler polaritelerine ve asit-baz özelliklerine göre şu gruplara ayrılabilir: polar olmayan (hidrofobik), polar (yüksüz), asidik veya bazik (Şekil 1'de gösterildiği gibi).Bir peptit dizisinde, diziyi oluşturan amino asitler çoğunlukla Sistein, Glutamin, Asparajin, Serin, Treonin, Tirozin vb. gibi polar olanlardan (Şekil 1'de pembe renkle işaretlendiği gibi) oluşuyorsa bu peptidin güçlü bir özelliği olabilir. Polarite ve suda oldukça çözünür.Bu güçlü polar peptit numunelerinin ters faz kromatografisi ile saflaştırılması prosedürü sırasında, hidrofobik faz çökmesi adı verilen bir olay meydana gelecektir (Santai Technologies tarafından daha önce yayınlanmış bir uygulama notuna bakın: Hidrofobik Faz Çöküşü, AQ Ters Faz Kromatografi Kolonları ve Uygulamaları).Normal C18 kolonlarıyla karşılaştırıldığında geliştirilmiş C18AQ kolonları, güçlü polar veya hidrofilik numunelerin saflaştırılması için en uygun olanıdır.Bu yazıda örnek olarak güçlü bir polar peptid kullanıldı ve bir C18AQ kolonu ile saflaştırıldı.Sonuç olarak gereksinimleri karşılayan hedef ürün elde edildi ve bundan sonraki araştırma ve geliştirmelerde kullanılabilir.
| Enstrüman | SepaBean™makine 2 | |||
| Kartuşlar | 12 g SepaFlash C18 RP flaş kartuşu (küresel silika, 20 - 45 μm, 100 Å, Sipariş numarası:SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flaş kartuşu (küresel silika, 20 - 45 μm, 100 Å, Sipariş numarası:SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Dalgaboyu | 254 nm, 220 nm | 214 deniz mili | ||
| Mobil aşama | Çözücü A: Su Çözücü B: Asetonitril | |||
| Akış hızı | 15 mL/dak | 20 mL/dak | ||
| Örnek yükleme | 30 mg | |||
| Gradyan | Zaman (CV) | Çözücü B (%) | Süre (dk) | Çözücü B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Sonuçlar ve tartışma
Normal C18 kolonu ile C18AQ kolonu arasındaki polar peptid numunesinin saflaştırma performansını karşılaştırmak için, başlangıç olarak numunenin flaş saflaştırması için normal bir C18 kolonu kullandık.Şekil 2'de gösterildiği gibi, yüksek sulu oranın neden olduğu C18 zincirlerinin hidrofobik faz çökmesi nedeniyle, numune normal C18 kartuşunda zorlukla tutuldu ve mobil faz tarafından doğrudan elüt edildi.Sonuç olarak numune etkili bir şekilde ayrılmadı ve saflaştırılmadı.
Şekil 2. Normal bir C18 kartuş üzerindeki numunenin flaş kromatogramı.
Daha sonra numunenin flaş saflaştırması için bir C18AQ kolonu kullandık.Şekil 3'te gösterildiği gibi peptit kolon üzerinde etkili bir şekilde tutuldu ve daha sonra elüte edildi.Hedef ürün, ham numunedeki safsızlıklardan ayrıldı ve toplandı.Liyofilizasyondan sonra ve HPLC ile analiz edildikten sonra saflaştırılmış ürün %98,2'lik bir saflığa sahiptir ve bir sonraki araştırma ve geliştirme adımı için ayrıca kullanılabilir.
Şekil 3. C18AQ kartuşundaki numunenin flaş kromatogramı.
Sonuç olarak, SepaFlash C18AQ RP flaş kartuşu, flaş kromatografi sistemi SepaBean ile birleştirildi™makine, güçlü polar veya hidrofilik numunelerin saflaştırılması için hızlı ve etkili bir çözüm sunabilir.
Santai Technology'den farklı özelliklere sahip bir dizi SepaFlash C18AQ RP flaş kartuşu bulunmaktadır (Tablo 2'de gösterildiği gibi).
| Ürün numarası | Sütun Boyutu | Akış hızı (mL/dak) | Maksimum basınç (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 gram | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 gr | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 gr | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 gram | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 gr | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 gr | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 gram | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 gr | 40-80 | 250/17,2 |
Tablo 2. SepaFlash C18AQ RP flaş kartuşları.Ambalaj malzemeleri: Yüksek verimli küresel C18(AQ) bağlı silika, 20 - 45 μm, 100 Å.
SepaBean™ makinesinin ayrıntılı özellikleri hakkında daha fazla bilgi veya SepaFlash serisi flash kartuşların sipariş bilgileri için lütfen web sitemizi ziyaret edin.
Gönderim zamanı: 12 Ekim 2018