Hongcheng Wang, Bo Xu
Uygulama Ar -Ge Merkezi
giriiş
Sabit faz ve mobil fazın nispi polaritelerine göre, sıvı kromatografisi normal faz kromatografisine (NPC) ve ters faz kromatografisine (RPC) bölünebilir. RPC için, mobil fazın polaritesi sabit fazınkinden daha güçlüdür. RPC, yüksek verimliliği, iyi çözünürlük ve net tutma mekanizması nedeniyle sıvı kromatografisi ayırma modlarında en yaygın olarak kullanılan haline gelmiştir. Bu nedenle RPC, alkaloidler, karbonhidratlar, yağ asitleri, steroidler, nükleik asitler, amino asitler, peptitler, proteinler, amino asitler, peptitler, proteinler, amino olmayan bileşiklerin ayrılması ve saflaştırılması için uygundur, en yaygın olarak kullanılan kırtasiye fazı, C8, CYA, CYA, CYA, CYA, CYA, CYA, çeşitli işlevler dahil, çeşitli fonksiyon gruplarıdır, çeşitli fonksiyonlar da dahil olmak üzere, çeşitli fonksiyon grupları, çeşitli fonksiyonlar dahildir, çeşitli işlevler, çeşitli işlevler dahil, cY, çeşitli fonksiyonlar da dahil olmak üzere, CYA, cYY, cy, cYA, cYA, cYA, cYA, cYA, cYA, cYA, cYA, cYA, cYA, cYA, cYA, cYA, cYA, cy, bağlanmıştır. Amino, vb. Bu bağlı fonksiyonel gruplar arasında en yaygın kullanılan gruplar C18'dir. RPC'nin% 80'inden fazlasının C18 bağlı faz kullandığı tahmin edilmektedir. Bu nedenle C18 Kromatografi sütunu, her laboratuvar için olması gereken bir evrensel sütun haline gelmiştir.
Bununla birlikte, C18 sütunu çok geniş bir uygulamada kullanılabilse de, çok polar veya yüksek hidrofilik olan bazı numuneler için, normal C18 sütunları bu tür numuneleri arındırmak için kullanılırken sorun yaşayabilir. RPC'de, yaygın olarak kullanılan elüsyon çözücüleri polaritesine göre sipariş edilebilir: su <metanol <asetonitril <etanol <tetrahidrofuran <izopropanol. Bu numuneler için kolonda iyi tutulmasını sağlamak için (güçlü polar veya yüksek hidrofilik), mobil faz olarak yüksek oranda sulu sistem kullanılması gerekir. Bununla birlikte, mobil faz olarak saf su sistemi (saf su veya saf tuz çözeltisi dahil) kullanılırken, C18 kolonunun sabit fazındaki uzun karbon zinciri, sudan kaçınma ve birbirleriyle karışma eğilimindedir, bu da kolonun tutma kapasitesinde anlık bir azalmaya veya hatta tutulmaya neden olur. Bu fenomene “hidrofobik faz çökmesi” denir (Şekil 1'in sol kısmında gösterildiği gibi). Sütun metanol veya asetonitril gibi organik çözücülerle yıkandığında bu durum tersinir olsa da, yine de kolonda hasara neden olabilir. Bu nedenle, bu durumun gerçekleşmesini önlemek gerekir.
Şekil 1. Normal C18 kolonunda (solda) ve C18AQ kolonunda (sağda) bağlı aşamaların silika jel yüzeyindeki şematik diyagramı.
Yukarıda belirtilen sorunları ele almak için, kromatografik paketleme malzemeleri üreticileri teknik iyileştirmeler yapmıştır. Bu iyileştirmelerden biri, silika jelin yüzeyini daha hidrofilik hale getirmek için hidrofilik siyano gruplarının (Şekil 1'in sağ kısmında gösterildiği gibi) tanıtımı gibi silika matrisinin yüzeyinde bazı değişiklikler yapmaktır. Böylece silika yüzeyindeki C18 zincirleri oldukça sulu koşullar altında tamamen uzatılabilir ve hidrofobik faz çöküşünden kaçınılabilir. Bu modifiye edilmiş C18 sütunlarına, oldukça sulu elüsyon koşulları için tasarlanmış ve% 100 sulu sistemi tolere edebilen sulu C18 sütunları, yani C18AQ sütunları denir. C18AQ kolonları, organik asitler, peptitler, nükleositler ve suda çözünür vitaminler dahil olmak üzere güçlü polar bileşiklerin ayrılmasında ve saflaştırılmasında yaygın olarak uygulanmıştır.
Tuzdan çıkarma, sonraki çalışmalarda numunenin uygulanmasını kolaylaştırmak için numune çözücü içindeki tuz veya tampon bileşenlerini kaldıran numuneler için flaş saflaştırmasındaki C18AQ kolonlarının tipik uygulamalarından biridir. Bu yazıda, örnek olarak güçlü polariteye sahip parlak mavi FCF kullanıldı ve C18AQ sütununda saflaştırıldı. Numune çözücü, tampon çözeltisinden organik çözücü ile değiştirildi, böylece aşağıdaki döner buharlaşmayı kolaylaştırdı, ayrıca çözücüler ve çalışma süresi tasarrufu sağlandı. Ayrıca, numunenin saflığı, numunedeki bazı safsızlıklar çıkarılarak iyileştirilmiştir.
Deney bölümü
Şekil 2. Numunenin kimyasal yapısı.
Parlak mavi FCF bu yazıda örnek olarak kullanıldı. Ham numunenin saflığı% 86 idi ve numunenin kimyasal yapısı Şekil 2'de gösterildi. Numune çözeltisini hazırlamak için, 300 mg pudra pudra katı, parlak mavi FCF'nin 1 m NAH2PO4 tampon çözeltisi içinde çözüldü ve tamamen net bir çözelti olmak için iyice sallandı. Örnek çözeltisi daha sonra bir enjektör tarafından flaş kolonuna enjekte edildi. Flaş saflaştırmasının deneysel kurulumu Tablo 1'de listelenmiştir.
| Enstrüman | Sepabean ™ makinesi2 | |||
| Kartuşlar | 12 G Sepaflash C18 RP Flaş Kartuşu (Küresel Silika, 20-45 μm, 100 Å, Sipariş Numarası: SW-5222-012-SP) | 12 G Sepaflash C18AQ RP Flaş Kartuşu (Küresel Silika, 20-45 μm, 100 Å, Sipariş Numarası ： SW-522-012-SP (AQ)） | ||
| Dalga boyu | 254 nm | |||
| Mobil aşama | Çözücü ： su Solvent B ： Metanol | |||
| Akış hızı | 30 ml/dakika | |||
| Örnek Yükleme | 300 mg (%86 saflığı olan parlak mavi FCF) | |||
| Eğim | Zaman (CV) | Çözücü B (%) | Zaman (CV) | Çözücü B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Sonuçlar ve tartışma
Numune tahliyesi ve saflaştırma için bir Sepaflash C18AQ RP flaş kartuşu kullanıldı. ELUTION'un başlangıcında mobil faz olarak saf suyun kullanıldığı ve 10 sütun hacmi (CV) için çalıştırıldığı adım gradyanı kullanıldı. Şekil 3'te gösterildiği gibi, mobil faz olarak saf su kullanılırken, numune flaş kartuşunda tamamen tutuldu. Daha sonra, mobil fazdaki metanol doğrudan% 100'e çıkarıldı ve gradyan 7.5 kV için tutuldu. Numune 11.5 ila 13.5 cv arasında elüte edildi. Toplanan fraksiyonlarda, numune çözeltisi NAH2PO4 tampon çözeltisinden metanole değiştirildi. Oldukça sulu çözelti ile karşılaştırıldığında, metanolün sonraki adımda döner buharlaşma ile çıkarılması çok daha kolaydı, bu da aşağıdaki araştırmayı kolaylaştırdı.
Şekil 3. Bir C18AQ kartuşu üzerindeki numunenin flaş kromatogramı.
Güçlü polarite örnekleri için C18AQ kartuşunun ve normal C18 kartuşunun tutma davranışını karşılaştırmak için paralel karşılaştırma testi yapıldı. Bir sepaflash C18 RP flaş kartuşu kullanıldı ve numune için flaş kromatogramı Şekil 4'te gösterilmiştir. Düzenli C18 kartuşları için en yüksek tolere edilen sulu faz oranı yaklaşık%90'dır. Bu nedenle başlangıç gradyanı% 90 suda% 10 metanol olarak ayarlandı. Şekil 4'te gösterildiği gibi, yüksek sulu oranın neden olduğu C18 zincirlerinin hidrofobik faz çökmesi nedeniyle, numune normal C18 kartuşunda zar zor tutuldu ve doğrudan mobil faz tarafından elüde edildi. Sonuç olarak, numune tahriş edici veya saflaştırmanın çalışması tamamlanamaz.
Şekil 4. Numunenin normal bir C18 kartuşu üzerinde flaş kromatogramı.
Doğrusal gradyanla karşılaştırıldığında, adım gradyanının kullanımı aşağıdaki avantajlara sahiptir:
1. Numune saflaştırma için çözücü kullanımı ve çalışma süresi azalır.
2. Hedef ürün, toplanan fraksiyonların hacmini azaltan ve böylece aşağıdaki döner buharlaşmanın yanı sıra zaman tasarrufunu kolaylaştıran keskin bir zirvede elerikler.
3. Toplanan ürün, buharlaştırılması kolay olan metanol içindedir, böylece kurutma süresi azalır.
Sonuç olarak, güçlü polar veya yüksek hidrofilik olan numunenin saflaştırılması için, preparatif flaş kromatografisi sistemi Sepabean ™ makinesi ile birleştirilen Sepaflash C18AQ RP flaş kartuşları hızlı ve verimli bir çözüm sunabilir.
Sepaflash bağlı Serisi C18 RP flaş kartuşları hakkında
Santai teknolojisinden farklı özelliklere sahip bir dizi Sepaflash C18AQ RP flaş kartuşları vardır (Tablo 2'de gösterildiği gibi).
| Öğe numarası | Sütun boyutu | Akış hızı (ml/dk) | Maks. Baskı (psi/çubuk) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tablo 2. Sepaflash C18AQ RP Flash Kartuşlar.
Paketleme Malzemeleri: Yüksek Verimli Küresel C18 (AQ)-Bidalı Silika, 20-45 μm, 100 Å.
logy (Tablo 2'de gösterildiği gibi).
Gönderme Zamanı: Ağustos-27-2018