Hongcheng Wang, Bo Xu
Uygulama Ar-Ge Merkezi
giriiş
Sabit faz ve hareketli fazın göreli polaritelerine göre, sıvı kromatografi normal faz kromatografisi (NPC) ve ters faz kromatografisi (RPC) olarak ikiye ayrılabilir.RPC için hareketli fazın polaritesi, sabit fazınkinden daha güçlüdür.RPC, yüksek verimliliği, iyi çözünürlüğü ve net tutma mekanizması nedeniyle sıvı kromatografi ayırma modlarında en yaygın kullanılanı haline geldi.Bu nedenle RPC, alkaloitler, karbonhidratlar, yağ asitleri, steroidler, nükleik asitler, amino asitler, peptitler, proteinler, vb. dahil olmak üzere çeşitli polar veya polar olmayan bileşiklerin ayrılması ve saflaştırılması için uygundur. RPC'de en yaygın kullanılan durağan fazdır. C18, C8, C4, fenil, siyano, amino vb. gibi çeşitli fonksiyonel gruplarla bağlanan silika jel matrisi. Bu bağlı fonksiyonel gruplar arasında en yaygın kullanılanı C18'dir.RPC'nin %80'inden fazlasının şu anda C18 bağlı faz kullandığı tahmin edilmektedir.Bu nedenle C18 kromatografi kolonu, her laboratuvar için olmazsa olmaz evrensel bir kolon haline gelmiştir.
C18 kolonu çok geniş bir uygulama yelpazesinde kullanılabilse de, çok polar veya oldukça hidrofilik olan bazı numuneler için normal C18 kolonları, bu tür numuneleri saflaştırmak için kullanıldığında problemler yaşayabilir.RPC'de yaygın olarak kullanılan elüsyon solventleri polaritelerine göre sıralanabilir: su < metanol < asetonitril < etanol < tetrahidrofuran < izopropanol.Bu numuneler için (güçlü polar veya oldukça hidrofilik) kolon üzerinde iyi bir tutuş sağlamak için, hareketli faz olarak kullanılmak üzere yüksek oranda sulu sistem gereklidir.Bununla birlikte, mobil faz olarak saf su sistemi (saf su veya saf tuz çözeltisi dahil) kullanıldığında, C18 kolonunun sabit fazındaki uzun karbon zinciri, sudan kaçınma ve birbiriyle karışma eğilimindedir, bu da ani bir azalmaya neden olur. sütunun tutma kapasitesi veya hatta tutma olmaması.Bu fenomene "hidrofobik faz çökmesi" denir (Şekil 1'in sol tarafında gösterildiği gibi).Kolon metanol veya asetonitril gibi organik çözücülerle yıkandığında bu durum tersine çevrilebilse de, yine de kolona zarar verebilir.Bu nedenle, bu durumun oluşmasını önlemek gerekir.
Şekil 1. Düzenli C18 kolonunda (solda) ve C18AQ kolonunda (sağda) silika jel yüzeyindeki bağlı fazların şematik diyagramı.
Yukarıda belirtilen sorunları çözmek için, kromatografik paketleme malzemeleri üreticileri teknik iyileştirmeler yapmıştır.Bu iyileştirmelerden biri, silis jelinin yüzeyini daha hidrofilik hale getirmek için (Şekil 1'in sağ kısmında gösterildiği gibi) hidrofilik siyano gruplarının dahil edilmesi gibi silika matrisinin yüzeyinde bazı modifikasyonlar yapmaktır.Böylece, silika yüzeyindeki C18 zincirleri, oldukça sulu koşullar altında tamamen uzatılabilir ve hidrofobik fazın çökmesi önlenebilir.Bu modifiye edilmiş C18 kolonlarına sulu C18 kolonları, yani C18AQ kolonları denir ve bunlar yüksek derecede sulu elüsyon koşulları için tasarlanmıştır ve %100 sulu sistemi tolere edebilir.C18AQ kolonları, organik asitler, peptitler, nükleositler ve suda çözünen vitaminler dahil olmak üzere güçlü polar bileşiklerin ayrılması ve saflaştırılmasında yaygın olarak uygulanmaktadır.
Tuzdan arındırma, sonraki çalışmalarda numunenin uygulanmasını kolaylaştırmak için numune solventindeki tuz veya tampon bileşenlerini uzaklaştıran numuneler için flaş saflaştırmada C18AQ kolonlarının tipik uygulamalarından biridir.Bu gönderide, numune olarak güçlü polariteye sahip Brilliant Blue FCF kullanıldı ve C18AQ kolonunda saflaştırıldı.Numune solventi, tampon çözeltiden organik solvent ile değiştirildi, böylece takip eden döner buharlaştırmanın yanı sıra solventlerden ve çalışma süresinden tasarruf sağlandı.Ayrıca, numunedeki bazı safsızlıklar giderilerek numunenin saflığı iyileştirildi.
Deneysel Bölüm
Şekil 2. Numunenin kimyasal yapısı.
Bu gönderide örnek olarak Brilliant Blue FCF kullanıldı.Ham numunenin saflığı %86 idi ve numunenin kimyasal yapısı Şekil 2'de gösterildi. Numune solüsyonunu hazırlamak için, 300 mg toz halindeki ham katı Brilliant Blue FCF, 1 M NaH2PO4 tampon solüsyonunda eritildi ve iyice çalkalandı. tamamen net bir çözüm.Numune solüsyonu daha sonra bir enjektör ile flaş kolonuna enjekte edildi.Flaş saflaştırmanın deneysel kurulumu Tablo 1'de listelenmiştir.
| Enstrüman | SepaBean™ Makinesi2 | |||
| Kartuşlar | 12 g SepaFlash C18 RP flaş kartuşu (küresel silika, 20 - 45 μm, 100 Å, Sipariş numarası: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flaş kartuşu (küresel silika, 20 - 45 μm, 100 Å, Sipariş numarası：SW-5222-012-SP(AQ))) | ||
| dalga boyu | 254 deniz mili | |||
| Mobil aşama | Çözücü A：Su Çözücü B：Metanol | |||
| Akış hızı | 30 mL/dk | |||
| Örnek yükleme | 300 mg (%86 saflıkta Brilliant Blue FCF) | |||
| Gradyan | Zaman (Özgeçmiş) | Çözücü B (%) | Zaman (Özgeçmiş) | Çözücü B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Sonuçlar ve tartışma
Örnek tuzdan arındırma ve saflaştırma için bir SepaFlash C18AQ RP flaş kartuşu kullanıldı.Elüsyon başlangıcında mobil faz olarak saf suyun kullanıldığı ve 10 kolon hacmi (CV) için çalıştırıldığı adım gradyanı kullanılmıştır.Şekil 3'te gösterildiği gibi, mobil faz olarak saf su kullanıldığında, numune tamamen flaş kartuşunda tutuldu.Daha sonra mobil fazdaki metanol doğrudan %100'e yükseltildi ve gradyan 7.5 CV olarak tutuldu.Numune 11.5'ten 13.5 CV'ye çıkarıldı.Toplanan fraksiyonlarda, numune solüsyonu NaH2PO4 tampon solüsyonundan metanole değiştirildi.Yüksek oranda sulu çözelti ile karşılaştırıldığında, metanolün sonraki adımda döner buharlaştırma ile çıkarılması çok daha kolaydı ve bu da sonraki araştırmayı kolaylaştırıyor.
Şekil 3. Bir C18AQ kartuşu üzerindeki numunenin flaş kromatogramı.
Güçlü polariteye sahip numuneler için C18AQ kartuşunun ve normal C18 kartuşunun tutma davranışını karşılaştırmak için paralel karşılaştırma testi gerçekleştirildi.Bir SepaFlash C18 RP flaş kartuşu kullanılmış ve numune için flaş kromatogramı Şekil 4'te gösterilmiştir. Normal C18 kartuşları için tolere edilen en yüksek sulu faz oranı yaklaşık %90'dır.Bu nedenle başlangıç gradyanı, %90 su içinde %10 metanol olarak ayarlandı.Şekil 4'te gösterildiği gibi, C18 zincirlerinin yüksek sulu oranın neden olduğu hidrofobik faz çökmesi nedeniyle, numune normal C18 kartuşunda zar zor tutuldu ve mobil faz tarafından doğrudan elüe edildi.Sonuç olarak, numune tuzdan arındırma veya saflaştırma işlemi tamamlanamaz.
Şekil 4. Normal bir C18 kartuşu üzerindeki numunenin flaş kromatogramı.
Doğrusal gradyan ile karşılaştırıldığında, kademeli gradyan kullanımı aşağıdaki avantajlara sahiptir:
1. Solvent kullanımı ve numune saflaştırması için çalışma süresi azalır.
2. Hedef ürün, toplanan fraksiyonların hacmini azaltan ve böylece takip eden döner buharlaştırmayı kolaylaştırmanın yanı sıra zamandan tasarruf sağlayan keskin bir pik ile ayrıştırılır.
3. Toplanan ürün, buharlaşması kolay olan metanol içindedir, dolayısıyla kuruma süresi kısalır.
Sonuç olarak, kuvvetli polar veya oldukça hidrofilik olan numunenin saflaştırılması için, hazırlayıcı flaş kromatografi sistemi SepaBean™ Machine ile birleşen SepaFlash C18AQ RP flaş kartuşları hızlı ve verimli bir çözüm sunabilir.
SepaFlash Bonded Series C18 RP flaş kartuşları hakkında
Santai Technology'den farklı özelliklere sahip bir dizi SepaFlash C18AQ RP flaş kartuşu vardır (Tablo 2'de gösterildiği gibi).
| Ürün numarası | Sütun Boyutu | Akış hızı (mL/dk) | Maksimum basınç (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 gr | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 gr | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 gr | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 gr | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 gr | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 gr | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 gram | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 gr | 40-80 | 250/17.2 |
Tablo 2. SepaFlash C18AQ RP flaş kartuşları.
Paketleme malzemeleri: Yüksek verimli küresel C18(AQ) bağlı silika, 20 - 45 μm, 100 Å.
(Tablo 2'de gösterildiği gibi).
Gönderim zamanı: 27 Ağu-2018