Hongcheng Wang, Bo Xu
Application R&D Center
Panimula
Ayon sa kamag -anak na polarities ng nakatigil na yugto at mobile phase, ang likidong chromatography ay maaaring nahahati sa normal na phase chromatography (NPC) at baligtad na phase chromatography (RPC). Para sa RPC, ang polarity ng mobile phase ay mas malakas kaysa sa nakatigil na yugto. Ang RPC ay naging pinaka -malawak na ginagamit sa isa sa mga mode ng paghihiwalay ng chromatography dahil sa mataas na kahusayan, mahusay na resolusyon at malinaw na mekanismo ng pagpapanatili. Therefore RPC is suitable for the separation and purification of various polar or non-polar compounds, including alkaloids, carbohydrates, fatty acids, steroids, nucleic acids, amino acids, peptides, proteins, etc. In RPC, the most commonly used stationary phase is the silica gel matrix which is bonded with various functional groups, including C18, C8, C4, phenyl, Ang cyano, amino, atbp. Tinatayang higit sa 80% ng RPC ang gumagamit na ngayon ng C18 na bonded phase. Samakatuwid ang haligi ng C18 Chromatography ay naging isang dapat na unibersal na haligi para sa bawat laboratoryo.
Bagaman ang haligi ng C18 ay maaaring magamit sa isang napakalawak na hanay ng mga aplikasyon, gayunpaman, para sa ilang mga sample na kung saan ay napaka polar o mataas na hydrophilic, ang mga regular na mga haligi ng C18 ay maaaring magkaroon ng mga problema kapag ginagamit upang linisin ang mga naturang sample. Sa RPC, ang karaniwang ginagamit na mga solvent ng elution ay maaaring mag -utos ayon sa kanilang polarity: tubig <methanol <acetonitrile <ethanol <tetrahydrofuran <isopropanol. Upang matiyak ang mahusay na pagpapanatili sa haligi para sa mga halimbawang ito (malakas na polar o mataas na hydrophilic), ang mataas na proporsyon ng may tubig na sistema ay kinakailangan upang magamit bilang mobile phase. Gayunpaman, kapag gumagamit ng purong sistema ng tubig (kabilang ang purong tubig o purong asin na solusyon) bilang mobile phase, ang mahabang carbon chain sa nakatigil na yugto ng haligi ng C18 ay may posibilidad na maiwasan ang tubig at ihalo sa bawat isa, na nagreresulta sa isang agarang pagbaba sa kapasidad ng pagpapanatili ng haligi o kahit na walang pagpapanatili. Ang kababalaghan na ito ay tinatawag na "pagbagsak ng hydrophobic phase" (tulad ng ipinapakita sa kaliwang bahagi ng Larawan 1). Kahit na ang sitwasyong ito ay mababalik kapag ang haligi ay hugasan ng mga organikong solvent tulad ng methanol o acetonitrile, maaari pa rin itong magdulot ng pinsala sa haligi. Samakatuwid, kinakailangan upang maiwasan ang nangyayari sa sitwasyong ito.
Larawan 1. Ang diagram ng eskematiko ng mga naka -bonding na phase sa ibabaw ng silica gel sa regular na haligi ng C18 (kaliwa) at haligi ng C18AQ (kanan).
Upang matugunan ang nabanggit na mga problema, ang mga tagagawa ng mga materyales sa pag -pack ng chromatographic ay gumawa ng mga pagpapabuti sa teknikal. Ang isa sa mga pagpapabuti na ito ay ang paggawa ng ilang mga pagbabago sa ibabaw ng silica matrix, tulad ng pagpapakilala ng mga pangkat ng hydrophilic cyano (tulad ng ipinapakita sa kanang bahagi ng Larawan 1), upang gawing mas maraming hydrophilic ang ibabaw ng silica gel. Sa gayon ang C18 chain sa ibabaw ng silica ay maaaring ganap na mapalawak sa ilalim ng lubos na may tubig na mga kondisyon at ang pagbagsak ng hydrophobic phase ay maiiwasan. Ang mga binagong mga haligi ng C18 ay tinatawag na may tubig na mga haligi ng C18, lalo na ang mga haligi ng C18AQ, na idinisenyo para sa lubos na may tubig na mga kondisyon ng elution at maaaring tiisin ang 100% may tubig na sistema. Ang mga haligi ng C18AQ ay malawak na inilalapat sa paghihiwalay at paglilinis ng mga malakas na compound ng polar, kabilang ang mga organikong acid, peptides, nucleosides at mga bitamina na natutunaw sa tubig.
Ang Desalting ay isa sa mga karaniwang aplikasyon ng mga haligi ng C18AQ sa flash purification para sa mga sample, na nag -aalis ng mga sangkap ng asin o buffer sa sample na solvent upang mapadali ang aplikasyon ng sample sa kasunod na pag -aaral. Sa post na ito, ang napakatalino na asul na FCF na may malakas na polaridad ay ginamit bilang sample at nalinis sa haligi ng C18AQ. Ang halimbawang solvent ay pinalitan ng organikong solvent mula sa solusyon ng buffer, sa gayon pinadali ang sumusunod na rotary evaporation pati na rin ang pag -save ng mga solvent at oras ng pagpapatakbo. Bukod dito, ang kadalisayan ng sample ay pinabuting sa pamamagitan ng pag -alis ng ilang mga impurities sa sample.
Seksyon ng Eksperimentong
Larawan 2. Ang istraktura ng kemikal ng sample.
Ang napakatalino na asul na FCF ay ginamit bilang sample sa post na ito. Ang kadalisayan ng hilaw na sample ay 86% at ang istraktura ng kemikal ng sample ay ipinakita sa Figure 2. Upang ihanda ang sample solution, 300 mg pulbos na krudo solid ng napakatalino na asul na FCF ay natunaw sa 1 M NAH2PO4 buffer solution at umiling nang maayos upang maging isang ganap na malinaw na solusyon. Ang sample solution ay pagkatapos ay na -injected sa haligi ng flash ng isang injector. Ang pang -eksperimentong pag -setup ng paglilinis ng flash ay nakalista sa Talahanayan 1.
| Instrumento | Sepabean ™ machine2 | |||
| Cartridges | 12 g Sepaflash C18 RP Flash Cartridge (Spherical Silica, 20-45 μm, 100 Å, Numero ng Order: SW-5222-012-SP) | 12 g sepaflash c18aq rp flash cartridge (spherical silica, 20-45 μm, 100 Å, numero ng order ： SW-5222-012-sp (aq)） | ||
| Haba ng haba | 254 nm | |||
| Mobile phase | Solvent a ： tubig Solvent b ： Methanol | |||
| Rate ng daloy | 30 ml/min | |||
| Halimbawang Paglo -load | 300 mg (Brilliant Blue FCF na may Kadalisayan ng 86%) | |||
| Gradient | Oras (CV) | Solvent B (%) | Oras (CV) | Solvent B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Mga resulta at talakayan
Ang isang sepaflash C18AQ RP flash cartridge ay ginamit para sa sample desalting at paglilinis. Ang hakbang na gradient ay ginamit kung saan ang purong tubig ay ginamit bilang mobile phase sa pagsisimula ng elution at tumakbo para sa 10 mga volume ng haligi (CV). Tulad ng ipinapakita sa Figure 3, kapag gumagamit ng purong tubig bilang mobile phase, ang sample ay ganap na napanatili sa flash cartridge. Susunod, ang methanol sa mobile phase ay direktang nadagdagan sa 100% at ang gradient ay pinananatili para sa 7.5 cv. Ang sample ay pinalabas mula 11.5 hanggang 13.5 cv. Sa mga nakolekta na mga praksyon, ang sample solution ay pinalitan mula sa NAH2PO4 buffer solution sa methanol. Ang paghahambing sa lubos na may tubig na solusyon, ang methanol ay mas madaling alisin sa pamamagitan ng rotary evaporation sa kasunod na hakbang, na pinadali ang sumusunod na pananaliksik.
Larawan 3. Ang flash chromatogram ng sample sa isang kartutso ng C18AQ.
Upang ihambing ang pagpapanatili ng pag -uugali ng C18AQ kartutso at regular na C18 kartutso para sa mga halimbawa ng malakas na polaridad, isinagawa ang kahanay na paghahambing sa pagsubok. Ang isang sepaflash C18 RP flash cartridge ay ginamit at ang flash chromatogram para sa sample ay ipinakita sa Figure 4. Para sa mga regular na C18 cartridges, ang pinakamataas na pinahihintulutang may aqueous phase ratio ay halos 90%. Samakatuwid ang start gradient ay naitakda sa 10% methanol sa 90% na tubig. Tulad ng ipinapakita sa Figure 4, dahil sa pagbagsak ng hydrophobic phase ng C18 chain na sanhi ng mataas na may tubig na ratio, ang sample ay bahagyang napanatili sa regular na C18 kartutso at direktang pinalabas ng mobile phase. Bilang isang resulta, ang pagpapatakbo ng sample desalting o paglilinis ay hindi maaaring makumpleto.
Larawan 4. Ang flash chromatogram ng sample sa isang regular na kartutso ng C18.
Ang paghahambing sa linear gradient, ang paggamit ng step gradient ay may mga sumusunod na pakinabang:
1. Ang paggamit ng solvent at oras ng pagtakbo para sa sample na paglilinis ay nabawasan.
2. Ang target na produkto ay nagpapahiwatig sa isang matalim na rurok, na binabawasan ang dami ng mga nakolekta na mga praksyon at sa gayon ay pinadali ang sumusunod na rotary evaporation pati na rin ang pag -save ng oras.
3. Ang nakolekta na produkto ay nasa methanol na madaling ma -evaporated, sa gayon ang oras ng pagpapatayo ay nabawasan.
Sa konklusyon, para sa paglilinis ng sample na kung saan ay malakas na polar o mataas na hydrophilic, sepaflash C18AQ RP flash cartridges na pinagsasama sa paghahanda ng flash chromatography system Sepabean ™ machine ay maaaring mag -alok ng isang mabilis at mahusay na solusyon.
Tungkol sa Sepaflash Bonded Series C18 RP Flash Cartridges
Mayroong isang serye ng sepaflash C18AQ RP flash cartridges na may iba't ibang mga pagtutukoy mula sa teknolohiya ng Santai (tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 2).
| Numero ng item | Laki ng haligi | Rate ng daloy (ml/min) | Max.pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Talahanayan 2. Sepaflash C18AQ RP Flash Cartridges.
Mga materyales sa pag-iimpake: Mataas na kahusayan spherical C18 (aq) -bonded silica, 20-45 μm, 100 Å.
logy (tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 2).
Oras ng Mag-post: Aug-27-2018