Hongcheng Wang, Bo Xu
แอปพลิเคชัน R&D Center
การแนะนำ
ตามขั้วสัมพัทธ์ของเฟสคงที่และเฟสเคลื่อนที่โครมาโตกราฟีของเหลวสามารถแบ่งออกเป็นโครมาโตกราฟีระยะปกติ (NPC) และโครมาโตกราฟีเฟสย้อนกลับ (RPC) สำหรับ RPC ขั้วของเฟสมือถือนั้นแข็งแกร่งกว่าระยะที่อยู่กับที่ RPC ได้กลายเป็นโหมดการแยกโครมาโตกราฟีของเหลวที่ใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดเนื่องจากมีประสิทธิภาพสูงความละเอียดที่ดีและกลไกการเก็บรักษาที่ชัดเจน ดังนั้น RPC จึงเหมาะสำหรับการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของสารประกอบขั้วต่าง ๆ หรือไม่ใช่ขั้วต่าง ๆ รวมถึงอัลคาลอยด์, คาร์โบไฮเดรต, กรดไขมัน, สเตียรอยด์, กรดนิวคลีอิก, กรดอะมิโน, เปปไทด์, โปรตีน ฯลฯ Cyano, Amino ฯลฯ ในกลุ่มการทำงานที่ถูกผูกมัดเหล่านี้กลุ่มที่ใช้กันอย่างแพร่หลายคือ C18 คาดว่ามากกว่า 80% ของ RPC กำลังใช้เฟสพันธบัตร C18 ดังนั้นคอลัมน์โครมาโตกราฟี C18 จึงกลายเป็นคอลัมน์สากลที่ต้องมีสำหรับทุกห้องปฏิบัติการ
แม้ว่าคอลัมน์ C18 สามารถใช้ในแอพพลิเคชั่นที่หลากหลาย แต่สำหรับตัวอย่างบางอย่างที่มีขั้วหรือ hydrophilic สูงคอลัมน์ C18 ปกติอาจมีปัญหาเมื่อใช้เพื่อชำระตัวอย่างดังกล่าว ใน RPC ตัวทำละลายที่ใช้กันทั่วไปสามารถสั่งซื้อตามขั้วของพวกเขา: น้ำ <เมทานอล <acetonitrile <เอทานอล <tetrahydrofuran <isopropanol เพื่อให้มั่นใจว่าการเก็บรักษาที่ดีในคอลัมน์สำหรับตัวอย่างเหล่านี้ (ขั้วที่แข็งแกร่งหรือ hydrophilic สูง) จำเป็นต้องใช้สัดส่วนที่สูงของระบบน้ำเป็นระยะเป็นเฟสเคลื่อนที่ อย่างไรก็ตามเมื่อใช้ระบบน้ำบริสุทธิ์ (รวมถึงน้ำบริสุทธิ์หรือสารละลายเกลือบริสุทธิ์) เป็นเฟสเคลื่อนที่ห่วงโซ่คาร์บอนยาวในเฟสคงที่ของคอลัมน์ C18 มีแนวโน้มที่จะหลีกเลี่ยงน้ำและผสมกันส่งผลให้ความสามารถในการเก็บรักษาของคอลัมน์ลดลงทันที ปรากฏการณ์นี้เรียกว่า "การยุบเฟสที่ไม่ชอบน้ำ" (ดังแสดงในส่วนซ้ายของรูปที่ 1) แม้ว่าสถานการณ์นี้จะย้อนกลับได้เมื่อคอลัมน์ถูกล้างด้วยตัวทำละลายอินทรีย์เช่นเมทานอลหรือ acetonitrile แต่ก็ยังสามารถสร้างความเสียหายให้กับคอลัมน์ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องป้องกันไม่ให้สถานการณ์นี้เกิดขึ้น
รูปที่ 1. แผนผังไดอะแกรมของเฟสที่ถูกผูกมัดบนพื้นผิวของซิลิกาเจลในคอลัมน์ C18 ปกติ (ซ้าย) และคอลัมน์ C18AQ (ขวา)
เพื่อแก้ไขปัญหาดังกล่าวข้างต้นผู้ผลิตวัสดุบรรจุภัณฑ์ chromatographic ได้ทำการปรับปรุงทางเทคนิค หนึ่งในการปรับปรุงเหล่านี้คือการปรับเปลี่ยนบางอย่างบนพื้นผิวของเมทริกซ์ซิลิกาเช่นการแนะนำของกลุ่มไซยาโนที่ชอบน้ำ (ดังแสดงในส่วนขวาของรูปที่ 1) เพื่อให้พื้นผิวของซิลิกาเจลมากขึ้น ดังนั้นโซ่ C18 บนพื้นผิวซิลิกาสามารถขยายได้อย่างเต็มที่ภายใต้สภาวะน้ำสูงและสามารถหลีกเลี่ยงการยุบตัวที่ไม่ชอบน้ำ คอลัมน์ C18 ที่ได้รับการแก้ไขเหล่านี้เรียกว่าคอลัมน์ Aqueous C18 คือคอลัมน์ C18AQ ซึ่งออกแบบมาสำหรับสภาพการชะล้างน้ำสูงและสามารถทนต่อระบบน้ำได้ 100% คอลัมน์ C18AQ ถูกนำไปใช้อย่างกว้างขวางในการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของสารประกอบขั้วที่แข็งแรงรวมถึงกรดอินทรีย์เปปไทด์นิวคลีโอไซด์และวิตามินที่ละลายน้ำได้
การแยกออกจากกันเป็นหนึ่งในแอปพลิเคชั่นทั่วไปของคอลัมน์ C18AQ ในการทำให้บริสุทธิ์แฟลชสำหรับตัวอย่างซึ่งจะลบส่วนประกอบเกลือหรือบัฟเฟอร์ในตัวทำละลายตัวอย่างเพื่ออำนวยความสะดวกในการประยุกต์ใช้ตัวอย่างในการศึกษาที่ตามมา ในโพสต์นี้ใช้ FCF สีน้ำเงินที่มีขั้วที่แข็งแกร่งถูกใช้เป็นตัวอย่างและทำให้บริสุทธิ์ในคอลัมน์ C18AQ ตัวทำละลายตัวอย่างถูกแทนที่ด้วยตัวทำละลายอินทรีย์จากสารละลายบัฟเฟอร์ดังนั้นจึงช่วยอำนวยความสะดวกในการระเหยแบบหมุนต่อไปนี้รวมถึงการประหยัดตัวทำละลายและเวลาในการทำงาน นอกจากนี้ความบริสุทธิ์ของตัวอย่างได้รับการปรับปรุงโดยการลบสิ่งสกปรกบางอย่างในตัวอย่าง
ส่วนทดลอง
รูปที่ 2. โครงสร้างทางเคมีของตัวอย่าง
FCF สีน้ำเงินสดใสถูกใช้เป็นตัวอย่างในโพสต์นี้ ความบริสุทธิ์ของตัวอย่างดิบคือ 86% และโครงสร้างทางเคมีของตัวอย่างแสดงในรูปที่ 2 เพื่อเตรียมสารละลายตัวอย่าง 300 มก. ของแข็งดิบของแข็งของแข็งของ FCF สีน้ำเงินที่สดใสถูกละลายในสารละลายบัฟเฟอร์ 1 M NAH2PO4 โซลูชันตัวอย่างจะถูกฉีดเข้าไปในคอลัมน์แฟลชโดยหัวฉีด การตั้งค่าการทดลองของการทำให้บริสุทธิ์แฟลชแสดงอยู่ในตารางที่ 1
| อุปกรณ์ | เครื่อง Sepabean ™2 | |||
| ตลับหมึก | 12 กรัม sepaflash C18 RP แฟลชคาร์ทริดจ์ (ซิลิกาทรงกลม, 20-45 μm, 100 Å, หมายเลขคำสั่งซื้อ: SW-5222-012-SP) | 12 กรัม sepaflash C18AQ RP คาร์ทริดจ์ (ซิลิกาทรงกลม, 20-45 μm, 100 Å, หมายเลขคำสั่งซื้อ： SW-5222-012-SP (AQ)- | ||
| ความยาวคลื่น | 254 นาโนเมตร | |||
| ขั้นตอนมือถือ | ตัวทำละลาย A： น้ำ ตัวทำละลาย B： เมทานอล | |||
| อัตราการไหล | 30 มล./นาที | |||
| การโหลดตัวอย่าง | 300 มก. (FCF สีน้ำเงินสดใสที่มีความบริสุทธิ์ 86%) | |||
| การไล่ระดับสี | เวลา (CV) | ตัวทำละลาย B (%) | เวลา (CV) | ตัวทำละลาย B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
ผลลัพธ์และการอภิปราย
คาร์ทริดจ์แฟลช Sepaflash C18AQ RP ใช้สำหรับการแยกตัวอย่างและการทำให้บริสุทธิ์ ขั้นตอนการไล่ระดับสีถูกนำมาใช้ในการใช้น้ำบริสุทธิ์เป็นเฟสมือถือในช่วงเริ่มต้นของการชะและเรียกใช้สำหรับ 10 คอลัมน์ปริมาตร (CV) ดังที่แสดงในรูปที่ 3 เมื่อใช้น้ำบริสุทธิ์เป็นเฟสเคลื่อนที่ตัวอย่างจะถูกเก็บไว้อย่างสมบูรณ์ในคาร์ทริดจ์แฟลช ถัดไปเมทานอลในเฟสมือถือจะเพิ่มขึ้นโดยตรงถึง 100% และการไล่ระดับสีได้รับการบำรุงรักษาสำหรับ 7.5 cv ตัวอย่างถูกชะออกจาก 11.5 ถึง 13.5 cv ในเศษส่วนที่เก็บรวบรวมสารละลายตัวอย่างถูกแทนที่จากสารละลายบัฟเฟอร์ NAH2PO4 ไปยังเมทานอล เมื่อเปรียบเทียบกับสารละลายที่มีน้ำสูงเมทานอลนั้นง่ายกว่ามากที่จะถูกลบออกโดยการระเหยแบบหมุนในขั้นตอนต่อไปซึ่งอำนวยความสะดวกในการวิจัยต่อไปนี้
รูปที่ 3. แฟลชโครมาโตแกรมของตัวอย่างบนตลับหมึก C18AQ
เพื่อเปรียบเทียบพฤติกรรมการเก็บรักษาของคาร์ทริดจ์ C18AQ และตลับหมึก C18 ปกติสำหรับตัวอย่างของขั้วที่แข็งแกร่งการทดสอบการเปรียบเทียบแบบขนานได้ดำเนินการ ใช้คาร์ทริดจ์ Sepaflash C18 RP RP และแฟลช chromatogram สำหรับตัวอย่างแสดงในรูปที่ 4 สำหรับคาร์ทริดจ์ C18 ปกติอัตราส่วนเฟสน้ำที่ทนได้สูงสุดอยู่ที่ประมาณ 90% ดังนั้นการไล่ระดับสีเริ่มต้นจึงตั้งอยู่ที่เมทานอล 10% ในน้ำ 90% ดังที่แสดงในรูปที่ 4 เนื่องจากการล่มสลายของเฟสที่ไม่ชอบน้ำของโซ่ C18 ที่เกิดจากอัตราส่วนน้ำสูงตัวอย่างแทบจะไม่ถูกเก็บไว้ในตลับ C18 ปกติและถูกชะออกโดยตรงจากเฟสเคลื่อนที่ เป็นผลให้การดำเนินการของการแยกตัวอย่างหรือการทำให้บริสุทธิ์ไม่สามารถเสร็จสิ้นได้
รูปที่ 4. โครมาโตแกรมแฟลชของตัวอย่างบนตลับ C18 ปกติ
เมื่อเปรียบเทียบกับการไล่ระดับสีเชิงเส้นการใช้ขั้นตอนการไล่ระดับสีมีข้อดีดังต่อไปนี้:
1. การใช้ตัวทำละลายและเวลาทำงานสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ตัวอย่างลดลง
2. ผลิตภัณฑ์เป้าหมาย elutes ในจุดสูงสุดที่คมชัดซึ่งจะช่วยลดปริมาณของเศษส่วนที่เก็บรวบรวมและช่วยอำนวยความสะดวกในการระเหยแบบหมุนต่อไปนี้รวมถึงการประหยัดเวลา
3. ผลิตภัณฑ์ที่เก็บรวบรวมอยู่ในเมทานอลซึ่งง่ายต่อการระเหยดังนั้นเวลาในการอบแห้งจึงลดลง
โดยสรุปสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ของตัวอย่างซึ่งเป็นขั้วโลกอย่างมากหรือ hydrophilic สูง sepaflash c18aq RP คาร์ทริดจ์แฟลชที่รวมกับระบบโครมาโตกราฟีแบบเรมาย
เกี่ยวกับคาร์ทริดจ์แฟลช Sepaflash Bonded Series C18 RP
มีชุดของคาร์ทริดจ์แฟลช Sepaflash C18AQ RP ที่มีข้อกำหนดที่แตกต่างจากเทคโนโลยี Santai (ดังแสดงในตารางที่ 2)
| หมายเลขรายการ | ขนาดคอลัมน์ | อัตราการไหล (ml/min) | สูงสุด (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 กรัม | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 กรัม | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 กรัม | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 กรัม | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 กรัม | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 กรัม | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 กรัม | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 กรัม | 40-80 | 250/17.2 |
ตารางที่ 2. Sepaflash C18AQ RP Flash Cartridges
วัสดุบรรจุภัณฑ์: ทรงกลมที่มีประสิทธิภาพสูง C18 (AQ)-ซิลิกาที่ถูกยึดไว้, 20-45 μm, 100 Å
logy (ดังแสดงในตารางที่ 2)
เวลาโพสต์: สิงหาคม -27-2018