Хончэн Ван, Бо Сю
Маркази татбиқи R&D
Муқаддима
Аз рӯи қутбҳои нисбии фазаи статсарӣ ва фазаи мобилӣ, хроматографияи моеъро ба хроматографияи фазавии муқаррарӣ (NPC) ва хроматографияи баръакси фазавӣ (RPC) тақсим кардан мумкин аст.Барои RPC, қутби фазаи мобилӣ нисбат ба марҳилаи статсионарӣ қавитар аст.RPC бо сабаби самаранокии баланд, ҳалли хуб ва механизми нигоҳдории равшани он дар режимҳои ҷудокунии хроматографияи моеъ маъмултарин истифода шудааст.Аз ин рӯ, RPC барои ҷудо кардан ва тоза кардани пайвастагиҳои гуногуни қутбӣ ё ғайриқутбӣ, аз ҷумла алкалоидҳо, карбогидратҳо, кислотаҳои равғанӣ, стероидҳо, кислотаҳои нуклеинӣ, аминокислотаҳо, пептидҳо, сафедаҳо ва ғайра мувофиқ аст. Дар RPC марҳилаи статсионарӣ бештар истифода мешавад. матритсаи силикагель, ки бо гурӯҳҳои гуногуни функсионалӣ, аз ҷумла C18, C8, C4, фенил, сиано, амино ва ғайра пайваст карда шудааст. Дар байни ин гурӯҳҳои функсионалии пайвастшуда, маъмултаринаш C18 мебошад.Тахмин меравад, ки зиёда аз 80% RPC ҳоло марҳилаи пайвастшудаи C18-ро истифода мебаранд.Аз ин рӯ, сутуни хроматографияи C18 ба сутуни универсалӣ барои ҳар як лаборатория табдил ёфтааст.
Гарчанде ки сутуни C18 метавонад дар доираи хеле васеи барномаҳо истифода шавад, аммо барои баъзе намунаҳое, ки хеле қутбӣ ё хеле гидрофилӣ мебошанд, сутунҳои муқаррарии C18 ҳангоми истифода барои тоза кардани чунин намунаҳо метавонанд мушкилот дошта бошанд.Дар RPC, ҳалкунандаҳои элюционии маъмулан истифодашавандаро мувофиқи қутбӣ фармоиш додан мумкин аст: об < метанол < ацетонитрил < этанол < тетрагидрофуран < изопропанол.Барои таъмини нигоҳдории хуб дар сутуни ин намунаҳо (қутбӣ қавӣ ё хеле гидрофилӣ), миқдори зиёди системаи обӣ бояд ҳамчун марҳилаи мобилӣ истифода шавад.Аммо, ҳангоми истифодаи системаи оби тоза (аз ҷумла оби соф ё маҳлули намак) ҳамчун марҳилаи мобилӣ, занҷири дарози карбон дар марҳилаи стационарии сутуни C18 майл дорад, ки аз об канорагирӣ кунад ва бо ҳамдигар омехта шавад, ки дар натиҷа якбора коҳиш меёбад қобилияти нигоҳдории сутун ё ҳатто нигоҳдорӣ.Ин њодисаро «фурўшавии фазаи гидрофобї» меноманд (чунон ки дар ќисми чапи расми 1 нишон дода шудааст).Гарчанде ки ин ҳолат ҳангоми шустани сутун бо ҳалкунандаҳои органикӣ ба монанди метанол ё ацетонитрил, баръакс аст, он ба ҳар ҳол метавонад ба сутун зарар расонад.Аз ин ру, ба ин вазъият рох надодан лозим аст.
Расми 1. Диаграммаи схематикии фазаҳои пайвастшуда дар сатҳи силикагель дар сутуни муқаррарии C18 (аз чап) ва сутуни C18AQ (рост).
Барои ҳалли мушкилоти дар боло зикршуда, истеҳсолкунандагони масолеҳи бастабандии хроматографӣ такмили техникиро анҷом доданд.Яке аз ин беҳбудиҳо дар рӯи матритсаи кремний ворид кардани баъзе тағйиротҳо мебошад, ба монанди ворид кардани гурӯҳҳои сианои гидрофиликӣ (тавре ки дар қисми рости расми 1 нишон дода шудааст) барои гидрофилӣ кардани сатҳи силикагель мебошад.Ҳамин тариқ, занҷирҳои C18 дар сатҳи кремний метавонад дар шароити обӣ пурра васеъ карда шавад ва аз шикастани фазаи гидрофобӣ пешгирӣ карда шавад.Ин сутунҳои тағирёфтаи C18 сутунҳои обии C18 номида мешаванд, яъне сутунҳои C18AQ, ки барои шароити обии баланд тарҳрезӣ шудаанд ва метавонанд 100% системаи обиро таҳаммул кунанд.Сутунҳои C18AQ дар ҷудо кардан ва тоза кардани пайвастагиҳои қутбӣ, аз ҷумла кислотаҳои органикӣ, пептидҳо, нуклеозидҳо ва витаминҳои дар об ҳалшаванда васеъ истифода мешаванд.
Намакзанӣ яке аз барномаҳои маъмулии сутунҳои C18AQ дар тозакунии флеш барои намунаҳо мебошад, ки ҷузъҳои намак ё буфериро дар ҳалкунандаи намуна хориҷ мекунад, то татбиқи намунаро дар таҳқиқоти минбаъда осон кунад.Дар ин паём, Brilliant Blue FCF бо қутбияти қавӣ ҳамчун намуна истифода шуд ва дар сутуни C18AQ тоза карда шуд.Намунаи ҳалкунанда бо маҳлули органикӣ аз маҳлули буферӣ иваз карда шуд, ба ин васила бухоршавии навбатии гардишро осон кард ва инчунин маҳлулҳо ва вақти корро сарфа кард.Ғайр аз он, тозагии намуна тавассути тоза кардани баъзе ифлосиҳо дар намуна беҳтар карда шуд.
Бахши таҷрибавӣ
Расми 2. Сохтори химиявии намуна.
Brilliant Blue FCF ҳамчун намуна дар ин паём истифода шудааст.Тозагии намунаи хом 86% буд ва сохтори кимиёвии намуна дар расми 2 нишон дода шудааст. Барои тайёр кардани маҳлули намуна, 300 мг хокаи хоки сахти Brilliant Blue FCF дар маҳлули буферии 1 M NaH2PO4 гудохта шуд ва хуб ҷунбиш кард, то ба он табдил ёбад. ҳалли комилан равшан.Сипас маҳлули намунавӣ тавассути инжектор ба сутуни флеш ворид карда шуд.Танзимоти таҷрибавии тозакунии флеш дар ҷадвали 1 оварда шудааст.
| Асбоб | Мошини SepaBean™2 | |||
| Картриджҳо | 12 г картриджи флеши SepaFlash C18 RP (силикашакли сферикӣ, 20 - 45 мкм, 100 Å, Рақами фармоиш: SW-5222-012-SP) | 12 г картриджи флеш SepaFlash C18AQ RP (силикашакл, 20 - 45 мкм, 100 Å, Рақами фармоиш: SW-5222-012-SP(AQ))) | ||
| Дарозии мавҷ | 254 нм | |||
| Марҳилаи мобилӣ | Халкунанда А: Об Халкунанда B: метанол | |||
| Суръати ҷараён | 30 мл/дақ | |||
| Боркунии намуна | 300 мг (Brilliant Blue FCF бо тозагии 86%) | |||
| Градиент | Вақт (CV) | ҳалкунанда B (%) | Вақт (CV) | ҳалкунанда B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Натиҷа ва Гуфтугӯ
Картриджи флеши SepaFlash C18AQ RP барои тоза кардани намак ва тозакунии намуна истифода шудааст.Градиенти қадам истифода шуд, ки дар он оби соф ҳамчун марҳилаи мобилӣ дар оғози элюсия истифода мешуд ва барои 10 ҳаҷми сутун (CV) кор мекард.Тавре ки дар расми 3 нишон дода шудааст, ҳангоми истифодаи оби соф ҳамчун марҳилаи мобилӣ, намуна пурра дар картридж нигоҳ дошта шуд.Минбаъд, метанол дар марҳилаи мобилӣ мустақиман то 100% зиёд карда шуд ва градиент барои 7,5 CV нигоҳ дошта шуд.Намуна аз 11,5 то 13,5 CV хориҷ карда шуд.Дар фраксияҳои ҷамъшуда, маҳлули намуна аз маҳлули буферии NaH2PO4 ба метанол иваз карда шуд.Дар муқоиса бо маҳлули хеле обӣ, хориҷ кардани метанол тавассути бухоркунии гардиш дар марҳилаи минбаъда хеле осонтар буд, ки ин ба таҳқиқоти зерин мусоидат мекунад.
Расми 3. Хроматограммаи флеши намуна дар картриджи C18AQ.
Барои муқоисаи рафтори нигоҳдории картриджи C18AQ ва картриджи муқаррарии C18 барои намунаҳои қутбияти қавӣ, санҷиши муқоисаи мувозӣ гузаронида шуд.Картриджи флеши SepaFlash C18 RP истифода шуд ва хроматограммаи флешдор барои намуна дар расми 4 нишон дода шудааст. Барои картриджҳои муқаррарии C18 таносуби баландтарини марҳилаи обии таҳаммулшаванда тақрибан 90% аст.Аз ин рӯ, градиенти ибтидоӣ дар 10% метанол дар 90% об муқаррар карда шуд.Тавре ки дар расми 4 нишон дода шудааст, аз сабаби суқути марҳилаи гидрофобии занҷирҳои C18, ки дар натиҷаи таносуби баланди обӣ ба вуҷуд омадааст, намуна дар картриджи муқаррарии C18 базӯр нигоҳ дошта шуд ва мустақиман тавассути фазаи мобилӣ хориҷ карда шуд.Дар натиҷа, амалиёти тоза кардани намак ё тозакунии намуна анҷом дода намешавад.
Расми 4. Хроматограммаи флеши намуна дар картриджи муқаррарии C18.
Дар муқоиса бо градиенти хатӣ, истифодаи градиенти қадам бартариҳои зерин дорад:
1. Истифодаи ҳалкунанда ва вақти кор барои тозакунии намуна кам карда мешавад.
2. Маҳсулоти мақсаднок дар як қуллаи тез ҷараён мегирад, ки ҳаҷми фраксияҳои ҷамъшударо коҳиш медиҳад ва ба ин васила ба бухоршавии гардиши навбатӣ ва сарфаи вақт мусоидат мекунад.
3. Маҳсулоти ҷамъовардашуда дар метанол аст, ки ба осонӣ бухор карда мешавад, бинобар ин вақти хушккунӣ кам мешавад.
Хулоса, барои тоза кардани намунае, ки хеле қутбӣ ё хеле гидрофилӣ аст, картриджҳои флеши SepaFlash C18AQ RP дар якҷоягӣ бо системаи хроматографияи тайёрии SepaBean™ метавонад ҳалли зуд ва муассирро пешниҳод кунанд.
Дар бораи картриджҳои флеши SepaFlash Bonded Series C18 RP
Як қатор картриджҳои флеши SepaFlash C18AQ RP бо хусусиятҳои гуногун аз Santai Technology мавҷуданд (тавре ки дар ҷадвали 2 нишон дода шудааст).
| Рақами адад | Андозаи сутун | Меъёри ҷараён (мл/дақ) | Максимум.Фишор (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 г | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 гр | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 гр | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 гр | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 гр | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 г | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 гр | 40-80 | 250/17.2 |
Ҷадвали 2. Cartridges флеш SepaFlash C18AQ RP.
Маводҳои бастабандӣ: Сферии баландсамараи кремнийи C18(AQ)-баста, 20 - 45 мкм, 100 Å.
логия (чунон ки дар чадвали 2 нишон дода шудааст).
Вақти интишор: 27 августи 2018