Hongcheng Wang, Bo Xu
Kituo cha R&D cha Maombi
Utangulizi
Kulingana na polarities jamaa za awamu ya stationary na awamu ya simu, kromatografia kioevu inaweza kugawanywa katika kromatografia ya awamu ya kawaida (NPC) na kromatografia ya awamu iliyogeuzwa (RPC).Kwa RPC, polarity ya awamu ya simu ni nguvu zaidi kuliko ile ya awamu ya stationary.RPC imekuwa ndiyo inayotumiwa zaidi katika njia za kutenganisha kromatografia kioevu kutokana na ufanisi wake wa juu, msongo mzuri na utaratibu wazi wa kubaki.Kwa hiyo RPC inafaa kwa ajili ya kutenganisha na kusafisha misombo mbalimbali ya polar au isiyo ya polar, ikiwa ni pamoja na alkaloidi, wanga, asidi ya mafuta, steroids, asidi ya nucleic, amino asidi, peptidi, protini, nk. Katika RPC, awamu ya stationary inayotumiwa zaidi ni. matrix ya gel ya silika ambayo inaunganishwa na vikundi mbalimbali vya utendaji, ikiwa ni pamoja na C18, C8, C4, phenyl, cyano, amino, nk. Miongoni mwa vikundi hivi vya utendaji vilivyounganishwa, moja inayotumiwa sana ni C18.Inakadiriwa kuwa zaidi ya 80% ya RPC sasa wanatumia awamu iliyounganishwa ya C18.Kwa hivyo safu wima ya kromatografia ya C18 imekuwa safu ya lazima iwe nayo kwa kila maabara.
Ingawa safu wima ya C18 inaweza kutumika katika aina mbalimbali za matumizi, hata hivyo, kwa baadhi ya sampuli ambazo ni polar sana au haidrofili nyingi, safu wima za C18 za kawaida zinaweza kuwa na matatizo zinapotumiwa kusafisha sampuli hizo.Katika RPC, vimumunyisho vinavyotumika kwa kawaida vinaweza kuagizwa kulingana na polarity yao: maji < methanol < acetonitrile < ethanol < tetrahydrofuran < isopropanol.Ili kuhakikisha uhifadhi mzuri kwenye safu kwa sampuli hizi (polar kali au haidrofili nyingi), kiwango cha juu cha mfumo wa maji ni muhimu kutumika kama awamu ya simu.Walakini, wakati wa kutumia mfumo wa maji safi (pamoja na maji safi au suluhisho la chumvi safi) kama sehemu inayosogea, mnyororo mrefu wa kaboni kwenye awamu ya kusimama ya safu ya C18 huelekea kuzuia maji na kuchanganyika na kila mmoja, na hivyo kusababisha kupungua kwa papo hapo. uwezo wa kuhifadhi safu au hata kutobaki.Jambo hili linaitwa "kuanguka kwa awamu ya hydrophobic" (kama inavyoonyeshwa katika sehemu ya kushoto ya Mchoro 1).Ingawa hali hii inaweza kutenduliwa wakati safu inapooshwa na vimumunyisho vya kikaboni kama vile methanoli au asetonitrile, bado inaweza kusababisha uharibifu kwenye safu.Kwa hiyo, ni muhimu kuzuia hali hii kutokea.
Kielelezo 1. Mchoro wa mchoro wa awamu zilizounganishwa kwenye uso wa gel ya silika katika safu ya kawaida ya C18 (kushoto) na safu ya C18AQ (kulia).
Ili kukabiliana na matatizo yaliyotajwa hapo juu, wazalishaji wa vifaa vya kufunga vya chromatographic wamefanya maboresho ya kiufundi.Mojawapo ya maboresho haya ni kufanya marekebisho kadhaa kwenye uso wa tumbo la silika, kama vile kuanzishwa kwa vikundi vya siano haidrofili (kama inavyoonyeshwa katika sehemu ya kulia ya Mchoro 1), ili kufanya uso wa gel ya silika kuwa haidrofili zaidi.Kwa hivyo minyororo ya C18 kwenye uso wa silika inaweza kupanuliwa kikamilifu chini ya hali ya maji mengi na kuanguka kwa awamu ya haidrofobu kunaweza kuepukwa.Safu hizi za C18 zilizorekebishwa huitwa safu wima za C18 zenye maji, yaani safu wima za C18AQ, ambazo zimeundwa kwa ajili ya hali ya maji yenye maji mengi na zinaweza kustahimili mfumo wa maji 100%.Nguzo za C18AQ zimetumika sana katika kutenganisha na kusafisha misombo yenye nguvu ya polar, ikiwa ni pamoja na asidi za kikaboni, peptidi, nucleosides na vitamini mumunyifu wa maji.
Kuondoa chumvi ni mojawapo ya matumizi ya kawaida ya safuwima za C18AQ katika utakaso mweko wa sampuli, ambao huondoa vijenzi vya chumvi au bafa kwenye kiyeyushio cha sampuli ili kuwezesha utumiaji wa sampuli katika tafiti zinazofuata.Katika chapisho hili, Brilliant Blue FCF yenye polarity kali ilitumika kama sampuli na kusafishwa kwenye safu wima ya C18AQ.Sampuli ya kutengenezea ilibadilishwa na kutengenezea kikaboni kutoka kwa suluhisho la bafa, na hivyo kuwezesha uvukizi wa mzunguko ufuatao na kuokoa viyeyusho na wakati wa kufanya kazi.Zaidi ya hayo, usafi wa sampuli uliboreshwa kwa kuondoa baadhi ya uchafu kwenye sampuli.
Sehemu ya Majaribio
Kielelezo 2. Muundo wa kemikali wa sampuli.
Brilliant Blue FCF ilitumika kama sampuli katika chapisho hili.Usafi wa sampuli mbichi ulikuwa 86% na muundo wa kemikali wa sampuli ulionyeshwa kwenye Mchoro 2. Ili kuandaa sampuli ya myeyusho, 300 mg ya unga ghafi ya unga wa Brilliant Blue FCF iliyeyushwa katika mmumunyo wa 1 M NaH2PO4 na kutikiswa vizuri na kuwa. suluhisho la wazi kabisa.Suluhisho la sampuli kisha hudungwa kwenye safu wima na kidungaji.Usanidi wa majaribio wa utakaso wa flash umeorodheshwa kwenye Jedwali la 1.
| Chombo | Mashine ya SepaBean™2 | |||
| Cartridges | 12 g SepaFlash C18 RP flash cartridge (silika ya spherical, 20 - 45 μm, 100 Å, Nambari ya agizo: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash cartridge (silika ya duara, 20 - 45 μm, 100 Å, Nambari ya agizo:SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Urefu wa mawimbi | 254 nm | |||
| Awamu ya rununu | Kimumunyisho A: Maji Kimumunyisho B: Methanoli | |||
| Kiwango cha mtiririko | 30 ml / min | |||
| Upakiaji wa sampuli | 300 mg (Brilliant Blue FCF na usafi wa 86%) | |||
| Gradient | Muda (CV) | Kiyeyushi B (%) | Muda (CV) | Kiyeyushi B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Matokeo na majadiliano
SepaFlash C18AQ RP flash cartridge ilitumika kwa sampuli ya kuondoa chumvi na utakaso.Mteremko wa hatua ulitumiwa ambapo maji safi yalitumiwa kama sehemu ya rununu mwanzoni mwa uboreshaji na kukimbia kwa juzuu 10 za safu (CV).Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro wa 3, wakati wa kutumia maji safi kama awamu ya simu, sampuli ilihifadhiwa kabisa kwenye cartridge ya flash.Kisha, methanoli katika awamu ya simu iliongezwa moja kwa moja hadi 100% na gradient ilidumishwa kwa 7.5 CV.Sampuli ilitolewa kutoka 11.5 hadi 13.5 CV.Katika sehemu zilizokusanywa, suluhisho la sampuli lilibadilishwa kutoka kwa suluhisho la bafa la NaH2PO4 hadi methanoli.Ikilinganisha na mmumunyo wenye maji mengi, methanoli ilikuwa rahisi zaidi kuondolewa kwa uvukizi wa mzunguko katika hatua inayofuata, ambayo inawezesha utafiti ufuatao.
Kielelezo 3. Chromatogram ya flash ya sampuli kwenye cartridge ya C18AQ.
Ili kulinganisha tabia ya uhifadhi wa cartridge ya C18AQ na cartridge ya kawaida ya C18 kwa sampuli za polarity kali, jaribio la kulinganisha sambamba lilifanyika.Katriji ya flash ya SepaFlash C18 RP ilitumiwa na chromatogram ya sampuli ilionyeshwa kwenye Mchoro 4. Kwa cartridges za kawaida za C18, uwiano wa juu wa awamu ya maji uliovumiliwa ni karibu 90%.Kwa hivyo gradient ya mwanzo iliwekwa kwa 10% methanoli katika 90% ya maji.Kama inavyoonyeshwa katika Mchoro wa 4, kutokana na kuanguka kwa awamu ya haidrofobi ya minyororo ya C18 iliyosababishwa na uwiano wa juu wa maji, sampuli iliwekwa kwa shida kwenye katriji ya kawaida ya C18 na ilitolewa moja kwa moja na awamu ya simu.Matokeo yake, uendeshaji wa sampuli desalting au utakaso hauwezi kukamilika.
Mchoro 4. Chromatogram ya flash ya sampuli kwenye cartridge ya kawaida ya C18.
Ikilinganisha na gradient ya mstari, matumizi ya gradient ya hatua yana faida zifuatazo:
1. Matumizi ya kutengenezea na muda wa kukimbia kwa utakaso wa sampuli umepunguzwa.
2. Bidhaa inayolengwa hutoka kwenye kilele mkali, ambayo hupunguza kiasi cha sehemu zilizokusanywa na hivyo kuwezesha uvukizi wa mzunguko wafuatayo pamoja na kuokoa muda.
3. Bidhaa iliyokusanywa iko kwenye methanoli ambayo ni rahisi kuyeyuka, kwa hivyo wakati wa kukausha hupunguzwa.
Kwa kumalizia, kwa ajili ya usafishaji wa sampuli ambayo ni ya ncha kali au haidrofili nyingi, katriji za SepaFlash C18AQ RP zinazochanganywa na mfumo wa kromatografia wa mweko wa SepaBean™ Mashine zinaweza kutoa suluhisho la haraka na bora.
Kuhusu SepaFlash Bonded Series C18 RP flash cartridges
Kuna mfululizo wa cartridges za SepaFlash C18AQ RP zenye vipimo tofauti kutoka kwa Teknolojia ya Santai (kama inavyoonyeshwa katika Jedwali la 2).
| Nambari ya Kipengee | Ukubwa wa Safu | Kiwango cha Mtiririko (mL/dakika) | Upeo.Shinikizo (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Jedwali 2. SepaFlash C18AQ RP flash cartridges.
Vifaa vya kufunga: Silika yenye ubora wa juu ya spherical C18(AQ)-iliyounganishwa, 20 - 45 μm, 100 Å.
logi (kama inavyoonyeshwa kwenye Jedwali 2).
Muda wa kutuma: Aug-27-2018