Hongcheng Wang, Bo Xu
Maombi ya R&D
Utangulizi
Kulingana na polarities za jamaa za awamu ya stationary na awamu ya rununu, chromatografia ya kioevu inaweza kugawanywa katika chromatografia ya awamu ya kawaida (NPC) na chromatografia ya awamu (RPC). Kwa RPC, polarity ya awamu ya rununu ina nguvu kuliko ile ya awamu ya stationary. RPC imekuwa moja inayotumika sana katika njia za kujitenga za chromatografia kwa sababu ya ufanisi mkubwa, azimio nzuri na utaratibu wazi wa uhifadhi. Kwa hivyo RPC inafaa kwa utenganisho na utakaso wa misombo anuwai ya polar au isiyo ya polar, pamoja na alkaloids, wanga, asidi ya mafuta, steroids, asidi ya kiini, asidi ya amino, peptides, protini, nk katika RPC, sehemu za kawaida zinazotumiwa ni pamoja na vikundi vya CEL4, Cun1 Ceptive, Cupy, Cupling, cupy, Cupling, Cup1, cupping, cupy, cupy, cupy, cupy, cup, cuptive, cup1 ceptive, cup1 C, cept, cept, cup, cup, cup1 cverti, cup1 ceptive, cup, cup, cup, cup, cup, cup, cup, cu. Cyano, amino, nk Kati ya vikundi hivi vya kazi vilivyo na dhamana, inayotumika sana ni C18. Inakadiriwa kuwa zaidi ya 80% ya RPC sasa hutumia awamu ya dhamana ya C18. Kwa hivyo safu ya C18 chromatografia imekuwa safu ya lazima kwa kila maabara.
Ingawa safu ya C18 inaweza kutumika katika matumizi anuwai sana, hata hivyo, kwa sampuli kadhaa ambazo ni za polar au hydrophilic sana, nguzo za kawaida za C18 zinaweza kuwa na shida wakati wa kutumiwa kusafisha sampuli kama hizo. Katika RPC, vimumunyisho vya kawaida vinavyotumiwa vinaweza kuamuru kulingana na polarity yao: maji <methanol <acetonitrile <ethanol <tetrahydrofuran <isopropanol. Kuhakikishia utunzaji mzuri kwenye safu ya sampuli hizi (polar kali au hydrophilic), idadi kubwa ya mfumo wa maji ni muhimu kutumiwa kama sehemu ya rununu. Walakini, wakati wa kutumia mfumo safi wa maji (pamoja na maji safi au suluhisho safi ya chumvi) kama sehemu ya rununu, mnyororo mrefu wa kaboni kwenye sehemu ya stationary ya safu ya C18 huelekea kuzuia maji na kuchanganyika na kila mmoja, na kusababisha kupungua kwa mara kwa mara kwa uwezo wa kutunza kwa safu au hata hakuna kutunza. Hali hii inaitwa "awamu ya hydrophobic kuanguka" (kama inavyoonyeshwa katika sehemu ya kushoto ya Kielelezo 1). Ingawa hali hii inabadilishwa wakati safu imeoshwa na vimumunyisho vya kikaboni kama vile methanoli au acetonitrile, bado inaweza kusababisha uharibifu kwenye safu. Kwa hivyo, inahitajika kuzuia hali hii kutokea.
Kielelezo 1. Mchoro wa skirini wa awamu zilizowekwa kwenye uso wa silika kwenye safu ya kawaida ya C18 (kushoto) na safu ya C18AQ (kulia).
Ili kushughulikia shida zilizotajwa hapo juu, watengenezaji wa vifaa vya upakiaji wa chromatographic wamefanya maboresho ya kiufundi. Mojawapo ya maboresho haya ni kufanya marekebisho kadhaa juu ya uso wa matrix ya silika, kama vile kuanzishwa kwa vikundi vya cyano ya hydrophilic (kama inavyoonyeshwa katika sehemu ya kulia ya Kielelezo 1), kufanya uso wa gel ya silika hydrophilic zaidi. Kwa hivyo minyororo ya C18 kwenye uso wa silika inaweza kupanuliwa kikamilifu chini ya hali ya maji sana na kuanguka kwa awamu ya hydrophobic kunaweza kuepukwa. Nguzo hizi zilizobadilishwa za C18 zinaitwa nguzo zenye maji C18, ambazo ni nguzo za C18AQ, ambazo zimetengenezwa kwa hali ya maji yenye maji mengi na zinaweza kuvumilia mfumo wa maji 100%. Nguzo za C18AQ zimetumika sana katika utenganisho na utakaso wa misombo yenye nguvu ya polar, pamoja na asidi ya kikaboni, peptides, nucleosides na vitamini vyenye mumunyifu.
Kuweka ni moja wapo ya matumizi ya kawaida ya nguzo za C18AQ katika utakaso wa flash kwa sampuli, ambazo huondoa vifaa vya chumvi au buffer kwenye sampuli ya kutengenezea kuwezesha utumiaji wa sampuli katika masomo ya baadaye. Katika chapisho hili, Blue Blue FCF yenye nguvu na polarity yenye nguvu ilitumika kama sampuli na iliyotakaswa kwenye safu ya C18AQ. Kutengenezea sampuli ilibadilishwa na kutengenezea kikaboni kutoka kwa suluhisho la buffer, na hivyo kuwezesha uvukizi unaofuata wa mzunguko na vile vile kuokoa vimumunyisho na wakati wa kufanya kazi. Kwa kuongezea, usafi wa sampuli uliboreshwa kwa kuondoa uchafu katika sampuli.
Sehemu ya majaribio
Kielelezo 2. Muundo wa kemikali wa sampuli.
FCF ya bluu yenye kipaji ilitumika kama mfano katika chapisho hili. Usafi wa sampuli mbichi ilikuwa 86% na muundo wa kemikali wa sampuli ulionyeshwa kwenye Mchoro 2. Kuandaa suluhisho la mfano, 300 mg poda ya poda iliyosafishwa ya Bluu ya Bluu FCF ilifutwa katika suluhisho la 1 M Nah2PO4 na kutikisa vizuri kuwa suluhisho wazi kabisa. Suluhisho la mfano liliingizwa kwenye safu ya flash na sindano. Usanidi wa majaribio ya utakaso wa flash umeorodheshwa kwenye Jedwali 1.
| Chombo | Mashine ya Sepabean ™2 | |||
| Cartridges | 12 G Sepaflash C18 RP Flash cartridge (silika ya spherical, 20-45 μm, 100 Å, nambari ya agizo: SW-5222-012-SP) | 12 G Sepaflash C18AQ RP Flash cartridge (silika ya spherical, 20-45 μm, 100 Å, nambari ya agizo: SW-5222-012-sp (aq)） | ||
| Wavelength | 254 nm | |||
| Awamu ya rununu | Kutengenezea: Maji Kutengenezea b: methanoli | |||
| Kiwango cha mtiririko | 30 ml/min | |||
| Upakiaji wa sampuli | 300 mg (Bluu Bluu FCF na usafi wa 86%) | |||
| Gradient | Wakati (CV) | Kutengenezea B (%) | Wakati (CV) | Kutengenezea B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Matokeo na majadiliano
Cartridge ya sepaflash C18AQ RP ilitumika kwa sampuli ya kusafisha na utakaso. Hatua ya gradient ilitumiwa ambayo maji safi yalitumika kama sehemu ya rununu mwanzoni mwa elution na kukimbia kwa safu 10 za safu (CV). Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 3, wakati wa kutumia maji safi kama sehemu ya rununu, sampuli ilihifadhiwa kabisa kwenye cartridge ya flash. Ifuatayo, methanoli katika awamu ya rununu iliongezeka moja kwa moja hadi 100% na gradient ilitunzwa kwa 7.5 cv. Sampuli hiyo ilitolewa kutoka 11.5 hadi 13.5 cv. Katika vipande vilivyokusanywa, suluhisho la sampuli lilibadilishwa kutoka suluhisho la buffer la NAH2PO4 kwa methanoli. Ukilinganisha na suluhisho lenye maji mengi, methanoli ilikuwa rahisi sana kuondolewa na uvukizi wa mzunguko katika hatua iliyofuata, ambayo inawezesha utafiti ufuatao.
Kielelezo 3. Chromatogram ya sampuli kwenye cartridge ya C18AQ.
Ili kulinganisha tabia ya uhifadhi wa cartridge ya C18AQ na cartridge ya kawaida ya C18 kwa sampuli za polarity kali, mtihani wa kulinganisha sambamba ulifanywa. Cartridge ya flash ya sepaflash C18 RP ilitumiwa na chromatogram ya sampuli ilionyeshwa kwenye Mchoro 4. Kwa cartridges za kawaida za C18, uwiano wa kiwango cha juu cha maji ni karibu 90%. Kwa hivyo gradient ya kuanza iliwekwa kwa 10% methanoli katika maji 90%. Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 4, kwa sababu ya kuanguka kwa awamu ya hydrophobic ya minyororo ya C18 iliyosababishwa na uwiano mkubwa wa maji, sampuli hiyo ilihifadhiwa kwenye cartridge ya kawaida ya C18 na ilibadilishwa moja kwa moja na awamu ya rununu. Kama matokeo, uendeshaji wa sampuli ya kusafisha au utakaso hauwezi kukamilika.
Kielelezo 4. Chromatogram ya sampuli kwenye cartridge ya kawaida ya C18.
Kulinganisha na gradient ya mstari, matumizi ya hatua ya gradient ina faida zifuatazo:
1. Matumizi ya kutengenezea na wakati wa kukimbia kwa utakaso wa sampuli hupunguzwa.
2. Bidhaa inayolenga huingia kwenye kilele mkali, ambayo hupunguza kiwango cha vipande vilivyokusanywa na hivyo kuwezesha uvukizi wa mzunguko unaofuata na wakati wa kuokoa.
3. Bidhaa iliyokusanywa iko katika methanoli ambayo ni rahisi kuyeyushwa, kwa hivyo wakati wa kukausha hupunguzwa.
Kwa kumalizia, kwa utakaso wa sampuli ambayo ni ya polar au hydrophilic sana, sepaflash C18AQ RP cartridges inayochanganya na mashine ya chromatografia ya mfumo wa Sepabean ™ inaweza kutoa suluhisho la haraka na bora.
Kuhusu safu za sepaflash zilizofungwa C18 RP Flash Cartridges
Kuna safu ya cartridges za sepaflash C18AQ RP na maelezo tofauti kutoka kwa teknolojia ya Santai (kama inavyoonyeshwa kwenye Jedwali 2).
| Nambari ya bidhaa | Saizi ya safu | Kiwango cha mtiririko (ml/min) | Max.pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (aq) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Jedwali 2. Sepaflash C18AQ RP Cartridges.
Vifaa vya Ufungashaji: Ufanisi wa hali ya juu wa C18 (aq)-silika, 20-45 μm, 100 Å.
logy (kama inavyoonyeshwa kwenye Jedwali 2).
Wakati wa chapisho: Aug-27-2018