Rui Huang, Bo Xu
Applikations FoU-center
Introduktion
En peptid är en förening som består av aminosyror, som var och en har unika fysikaliska och kemiska egenskaper på grund av de olika typerna och ordningen av aminosyrarester som utgör dess sekvens.Med utvecklingen av kemisk syntes i fast fas har den kemiska syntesen av olika aktiva peptider gjort stora framsteg.Men på grund av den komplicerade sammansättningen av peptiden som erhålls genom fastfassyntes, bör slutprodukten renas med tillförlitliga separationsmetoder.De vanligaste reningsmetoderna för peptider inkluderar jonbyteskromatografi (IEC) och omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (RP-HPLC), som har nackdelarna med låg provladdningskapacitet, höga kostnader för separationsmedier, komplicerad och kostsam separationsutrustning, etc. För snabb rening av småmolekylära peptider (MW < 1 kDa) har ett framgångsrikt applikationsfall tidigare publicerats av Santai Technologies, där en SepaFlash RP C18-patron användes för snabb rening av tymopentin (TP-5) och målprodukt som uppfyller kraven erhölls.
Figur 1. 20 vanliga aminosyror (återgivna från www.bachem.com).
Det finns 20 sorters aminosyror som är vanliga i sammansättningen av peptider.Dessa aminosyror kan delas in i följande grupper enligt deras polaritet och syra-basegenskap: opolär (hydrofob), polär (oladdad), sur eller basisk (som visas i figur 1).I en peptidsekvens, om aminosyrorna som utgör sekvensen mestadels är polära (som markerats med rosa färg i figur 1), såsom cystein, glutamin, asparagin, serin, treonin, tyrosin, etc. kan denna peptid ha en stark polaritet och vara mycket löslig i vatten.Under reningsproceduren för dessa starka polära peptidprover med omvänd faskromatografi kommer ett fenomen som kallas hydrofob faskollaps att inträffa (se en tidigare publicerad ansökan av Santai Technologies: Hydrophobic Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).Jämfört med de vanliga C18-kolonnerna är de förbättrade C18AQ-kolonnerna mest lämpade för rening av starka polära eller hydrofila prover.I det här inlägget användes en stark polär peptid som provet och renades av en C18AQ-kolonn.Som ett resultat erhölls målprodukten som uppfyller kraven och kunde användas i följande forskning och utveckling.
| Instrument | SepaBean™maskin 2 | |||
| Patroner | 12 g SepaFlash C18 RP-blixtpatron (sfärisk kiseldioxid, 20 - 45 μm, 100 Å, beställningsnummer: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP-blixtpatron (sfärisk kiseldioxid, 20 - 45 μm, 100 Å, beställningsnummer：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Våglängd | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobil fas | Lösningsmedel A: Vatten Lösningsmedel B: Acetonitril | |||
| Flödeshastighet | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Provladdning | 30 mg | |||
| Lutning | Tid (CV) | Lösningsmedel B (%) | Tid (min) | Lösningsmedel B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10,0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13,0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14,0 | 22 | |
| 19,0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18,0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22,0 | 87 | |||
| 29,0 | 87 | |||
Resultat och diskussion
För att jämföra reningsprestandan för det polära peptidprovet mellan vanlig C18-kolonn och C18AQ-kolonn, använde vi en vanlig C18-kolonn för snabbrening av provet som en början.Som visas i figur 2, på grund av den hydrofoba faskollapsen av C18-kedjorna orsakad av högt vattenhaltigt förhållande, hölls provet knappt kvar på den vanliga C18-patronen och eluerades direkt ut av den mobila fasen.Som ett resultat var provet inte effektivt separerat och renat.
Figur 2. Flashkromatogrammet av provet på en vanlig C18-patron.
Därefter använde vi en C18AQ-kolonn för snabbrening av provet.Såsom visas i figur 3 hölls peptiden effektivt kvar på kolonnen och eluerades sedan ut.Målprodukten separerades från föroreningarna i råprovet och samlades upp.Efter lyofilisering och sedan analyserad med HPLC har den renade produkten en renhet på 98,2 % och kan användas ytterligare för nästa steg i forskning och utveckling.
Figur 3. Flashkromatogrammet av provet på en C18AQ-patron.
Sammanfattningsvis, SepaFlash C18AQ RP-blixtpatron i kombination med blixtkromatografisystemet SepaBean™maskin kan erbjuda en snabb och effektiv lösning för rening av starka polära eller hydrofila prover.
Det finns en serie SepaFlash C18AQ RP-blixtpatroner med olika specifikationer från Santai Technology (som visas i tabell 2).
| Artikelnummer | Kolumnstorlek | Flödeshastighet (ml/min) | Max.tryck (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabell 2. SepaFlash C18AQ RP-blixtpatroner.Förpackningsmaterial: Högeffektiv sfärisk C18(AQ)-bunden kiseldioxid, 20 - 45 μm, 100 Å.
För ytterligare information om detaljerade specifikationer för SepaBean™-maskinen, eller beställningsinformation om SepaFlash-seriens flashkassetter, besök vår hemsida.
Posttid: 2018-12-12