Hongcheng Wang, Bo Xu
Applikations FoU-center
Introduktion
Enligt de relativa polariteterna för stationär fas och mobil fas kan vätskekromatografi delas in i normalfaskromatografi (NPC) och omvänd faskromatografi (RPC).För RPC är polariteten för den mobila fasen starkare än den för den stationära fasen.RPC har blivit den mest använda i vätskekromatografiseparationslägen på grund av dess höga effektivitet, goda upplösning och tydliga retentionsmekanism.Därför är RPC lämplig för separation och rening av olika polära eller opolära föreningar, inklusive alkaloider, kolhydrater, fettsyror, steroider, nukleinsyror, aminosyror, peptider, proteiner etc. I RPC är den vanligaste stationära fasen som används kiselgelmatrisen som är bunden med olika funktionella grupper, inklusive C18, C8, C4, fenyl, cyano, amino, etc. Bland dessa bundna funktionella grupper är den mest använda C18.Det uppskattas att mer än 80 % av RPC nu använder C18-bunden fas.Därför har C18-kromatografikolonn blivit en universell kolonn som måste ha för varje laboratorium.
Även om C18-kolonn kan användas i ett mycket brett spektrum av applikationer, men för vissa prover som är mycket polära eller mycket hydrofila, kan vanliga C18-kolonner ha problem när de används för att rena sådana prover.I RPC kan de vanligaste elueringslösningsmedlen beställas efter deras polaritet: vatten < metanol < acetonitril < etanol < tetrahydrofuran < isopropanol.För att säkerställa god retention på kolonnen för dessa prover (starka polära eller mycket hydrofila), är hög andel av vattenhaltigt system nödvändigt för att användas som den mobila fasen.Men när man använder rent vattensystem (inklusive rent vatten eller ren saltlösning) som den mobila fasen, tenderar den långa kolkedjan på den stationära fasen av C18-kolonnen att undvika vattnet och blandas med varandra, vilket resulterar i en omedelbar minskning av retentionskapacitet hos kolonnen eller till och med ingen retention.Detta fenomen kallas "hydrofob faskollaps" (som visas i den vänstra delen av figur 1).Även om denna situation är reversibel när kolonnen tvättas med organiska lösningsmedel såsom metanol eller acetonitril, kan den fortfarande orsaka skada på kolonnen.Därför är det nödvändigt att förhindra att denna situation inträffar.
Figur 1. Det schematiska diagrammet över de bundna faserna på ytan av silikagel i vanlig C18-kolonn (vänster) och C18AQ-kolonn (höger).
För att lösa de ovan nämnda problemen har tillverkarna av kromatografiska förpackningsmaterial gjort tekniska förbättringar.En av dessa förbättringar är att göra några modifieringar på ytan av kiseldioxidmatrisen, såsom införandet av hydrofila cyanogrupper (som visas i den högra delen av figur 1), för att göra ytan på kiselgelen mer hydrofil.Således kunde C18-kedjorna på kiseldioxidytan förlängas helt under mycket vattenhaltiga betingelser och den hydrofoba fasens kollaps kunde undvikas.Dessa modifierade C18-kolonner kallas vattenhaltiga C18-kolonner, nämligen C18AQ-kolonner, som är utformade för mycket vattenhaltiga elueringsförhållanden och kan tolerera 100 % vattenhaltigt system.C18AQ-kolonner har använts i stor utsträckning vid separation och rening av starka polära föreningar, inklusive organiska syror, peptider, nukleosider och vattenlösliga vitaminer.
Avsaltning är en av de typiska tillämpningarna av C18AQ-kolonner i snabbrening för prover, som tar bort salt- eller buffertkomponenterna i provlösningsmedlet för att underlätta appliceringen av provet i efterföljande studier.I det här inlägget användes Brilliant Blue FCF med stark polaritet som prov och renades på C18AQ-kolonnen.Provlösningsmedlet ersattes med organiskt lösningsmedel från buffertlösning, vilket underlättade följande rotationsindunstning samt sparade lösningsmedel och driftstid.Vidare förbättrades provets renhet genom att avlägsna vissa föroreningar i provet.
Experimentell sektion
Figur 2. Provets kemiska struktur.
Brilliant Blue FCF användes som prov i det här inlägget.Renheten hos råprovet var 86 % och provets kemiska struktur visades i figur 2. För att bereda provlösningen löstes 300 mg pulverformigt orent fast ämne av Brilliant Blue FCF i 1 M NaH2PO4 buffertlösning och skakades väl för att bli en helt klar lösning.Provlösningen injicerades sedan i flashkolonnen med en injektor.Den experimentella uppställningen av blixtreningen anges i tabell 1.
| Instrument | SepaBean™-maskin2 | |||
| Patroner | 12 g SepaFlash C18 RP-blixtpatron (sfärisk kiseldioxid, 20 - 45 μm, 100 Å, beställningsnummer: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP-blixtpatron (sfärisk kiseldioxid, 20 - 45 μm, 100 Å, beställningsnummer：SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Våglängd | 254 nm | |||
| Mobil fas | Lösningsmedel A: Vatten Lösningsmedel B: Metanol | |||
| Flödeshastighet | 30 ml/min | |||
| Provladdning | 300 mg (Brilliant Blue FCF med en renhet på 86%) | |||
| Lutning | Tid (CV) | Lösningsmedel B (%) | Tid (CV) | Lösningsmedel B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultat och diskussion
En SepaFlash C18AQ RP flashpatron användes för avsaltning och rening av prover.Steggradient användes i vilken rent vatten användes som den mobila fasen vid starten av elueringen och kördes i 10 kolonnvolymer (CV).Som visas i figur 3, när rent vatten användes som den mobila fasen, hölls provet helt kvar på flashpatronen.Därefter ökades metanolen i den mobila fasen direkt till 100 % och gradienten bibehölls vid 7,5 CV.Provet eluerades ut från 11,5 till 13,5 CV.I de uppsamlade fraktionerna ersattes provlösningen från NaH2PO4-buffertlösning till metanol.Jämfört med mycket vattenhaltig lösning var metanol mycket lättare att avlägsna genom rotationsindunstning i det efterföljande steget, vilket underlättar följande forskning.
Figur 3. Flashkromatogrammet av provet på en C18AQ-patron.
För att jämföra retentionsbeteendet för C18AQ-kassetten och vanlig C18-kassett för prover med stark polaritet, utfördes parallella jämförelsetest.En SepaFlash C18 RP flashpatron användes och flashkromatogrammet för provet visades i figur 4. För vanliga C18 patroner är det högsta tolererade vattenfasförhållandet cirka 90 %.Därför sattes startgradienten till 10 % metanol i 90 % vatten.Som visas i figur 4, på grund av den hydrofoba faskollapsen av C18-kedjorna orsakad av högt vattenhaltigt förhållande, hölls provet knappt kvar på den vanliga C18-patronen och eluerades direkt ut av den mobila fasen.Som ett resultat kan operationen av provavsaltning eller rening inte slutföras.
Figur 4. Flashkromatogrammet för provet på en vanlig C18-patron.
Jämfört med linjär gradient har användningen av steggradient följande fördelar:
1. Användning av lösningsmedel och körtid för provrening reduceras.
2. Målprodukten eluerar i en skarp topp, vilket minskar volymen av uppsamlade fraktioner och därmed underlättar den efterföljande rotationsindunstning samt sparar tid.
3. Den uppsamlade produkten är i metanol som är lätt att indunsta, på så sätt minskar torktiden.
Sammanfattningsvis, för rening av provet som är starkt polärt eller mycket hydrofilt, kan SepaFlash C18AQ RP-blixtpatroner i kombination med det preparativa flashkromatografisystemet SepaBean™ Machine erbjuda en snabb och effektiv lösning.
Om SepaFlash Bonded Series C18 RP-blixtpatroner
Det finns en serie SepaFlash C18AQ RP-blixtpatroner med olika specifikationer från Santai Technology (som visas i tabell 2).
| Artikelnummer | Kolumnstorlek | Flödeshastighet (ml/min) | Max.tryck (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabell 2. SepaFlash C18AQ RP-blixtpatroner.
Förpackningsmaterial: Högeffektiv sfärisk C18(AQ)-bunden kiseldioxid, 20 - 45 μm, 100 Å.
logik (som visas i tabell 2).
Posttid: 2018-aug-27