Hongcheng Wang, Bo Xu
Application FoU Center
Introduktion
Enligt de relativa polariteterna i stationär fas och mobil fas kan vätskekromatografi delas upp i normal faskromatografi (NPC) och omvänd faskromatografi (RPC). För RPC är polariteten i den mobila fasen starkare än den för den stationära fasen. RPC har blivit den mest använda en i vätskekromatografiseparationslägen på grund av dess höga effektivitet, god upplösning och tydlig retentionsmekanism. Therefore RPC is suitable for the separation and purification of various polar or non-polar compounds, including alkaloids, carbohydrates, fatty acids, steroids, nucleic acids, amino acids, peptides, proteins, etc. In RPC, the most commonly used stationary phase is the silica gel matrix which is bonded with various functional groups, including C18, C8, C4, phenyl, Cyano, amino, etc. Bland dessa bundna funktionella grupper är den mest använda en C18. Det uppskattas att mer än 80% av RPC nu använder C18 -bundna fas. Därför har C18-kromatografikolumn blivit en måste-ha universell kolonn för varje laboratorium.
Även om C18 -kolumnen kan användas i ett mycket brett utbud av applikationer, kan emellertid för vissa prover som är mycket polära eller mycket hydrofila, regelbundna C18 -kolumner ha problem när de används för att rena sådana prover. I RPC kan de vanligt använda elueringslösningsmedlen beställas enligt deras polaritet: vatten <metanol <acetonitril <etanol <tetrahydrofuran <isopropanol. För att säkerställa god retention på kolonnen för dessa prover (stark polär eller mycket hydrofil) är hög andel av vattenhaltigt system nödvändigt för att användas som mobilfas. Men när man använder rent vattensystem (inklusive rent vatten eller ren saltlösning) som den mobila fasen, tenderar den långa kolkedjan på den stationära fasen i C18 -kolonnen att undvika vattnet och blandas med varandra, vilket resulterar i en omedelbar minskning av kvarhållningskapaciteten för kolonnen eller till och med ingen retention. Detta fenomen kallas "hydrofob faskollaps" (som visas i den vänstra delen av figur 1). Även om denna situation är reversibel när kolonnen tvättas med organiska lösningsmedel såsom metanol eller acetonitril, kan den fortfarande orsaka skador på kolonnen. Därför är det nödvändigt att förhindra att denna situation händer.
Figur 1. Det schematiska diagrammet över de bundna faserna på ytan av kiselgel i regelbunden C18 -kolumn (vänster) och C18AQ -kolumn (höger).
För att ta itu med ovan nämnda problem har de kromatografiska förpackningsmaterialstillverkarna gjort tekniska förbättringar. En av dessa förbättringar är att göra några modifieringar på ytan av kiseldioxidmatrisen, såsom införandet av hydrofila cyanogrupper (som visas i den högra delen av figur 1), för att göra ytan på kiseldioxidgelen mer hydrofil. Således kunde C18 -kedjorna på kiseldioxidytan förlängas helt under mycket vattenhaltiga förhållanden och den hydrofoba faskollapsen kunde undvikas. Dessa modifierade C18 -kolumner kallas vattenhaltiga C18 -kolumner, nämligen C18AQ -kolumner, som är utformade för mycket vattenhaltiga elueringsförhållanden och tål 100% vattenhaltiga system. C18AQ-kolumner har applicerats i stor utsträckning vid separering och rening av starka polära föreningar, inklusive organiska syror, peptider, nukleosider och vattenlösliga vitaminer.
Desaltning är en av de typiska tillämpningarna av C18AQ -kolumner i blixtrening för prover, som tar bort salt- eller buffertkomponenterna i provlösningsmedlet för att underlätta applicering av provet i efterföljande studier. I det här inlägget användes den lysande blå FCF med stark polaritet som prov och renades i C18AQ -kolumnen. Provlösningsmedlet ersattes av organiskt lösningsmedel från buffertlösning, vilket underlättade följande roterande avdunstning samt sparande lösningsmedel och driftstid. Vidare förbättrades provets renhet genom att ta bort vissa föroreningar i provet.
Experimentavdelning
Figur 2. Provets kemiska struktur.
Den lysande blå FCF användes som provet i detta inlägg. Råprovets renhet var 86% och provets kemiska struktur visades i figur 2. För att framställa provlösningen löstes 300 mg pulverformigt rått fast ämne av lysande blå FCF i 1 M NAH2PO4 -buffertlösning och skakade väl för att bli en helt tydlig lösning. Provlösningen injicerades sedan i blixtkolonnen av en injektor. Den experimentella inställningen av flash -rening listas i tabell 1.
| Instrument | Sepabisk maskin2 | |||
| Patroner | 12 G SEPAFLASH C18 RP Flash Cartridge (sfärisk kiseldioxid, 20-45 μm, 100 Å, ordernummer: SW-5222-012-SP) | 12 G SEPAFLASH C18AQ RP Flash-patron (sfärisk kiseldioxid, 20-45 μm, 100 Å, ordernummer ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Våglängd | 254 nm | |||
| Mobilfas | Lösningsmedel A ： Vatten Lösningsmedel B ： Metanol | |||
| Flödeshastighet | 30 ml/min | |||
| Provbelastning | 300 mg (lysande blå FCF med renheten 86%) | |||
| Lutning | Tid (CV) | Lösningsmedel B (%) | Tid (CV) | Lösningsmedel B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultat och diskussion
En sepaflash C18AQ RP -flashkassett användes för provningsavsaltning och rening. Steggradient användes där rent vatten användes som den mobila fasen i början av eluering och kördes för 10 kolumnvolymer (CV). Som visas i figur 3, när man använde rent vatten som mobilfasen, bibehölls provet helt på flashpatronen. Därefter ökades metanolen i den mobila fasen direkt till 100% och lutningen bibehölls för 7,5 cV. Provet eluerades från 11,5 till 13,5 cv. I de uppsamlade fraktionerna ersattes provlösningen från NAH2PO4 -buffertlösning till metanol. Jämfört med mycket vattenlösning var metanol mycket lättare att avlägsnas genom rotationsindunstning i det efterföljande steget, vilket underlättar följande forskning.
Figur 3. Flash -kromatogrammet för provet på en C18AQ -patron.
För att jämföra kvarhållningsbeteendet för C18AQ -patron och regelbunden C18 -patron för prover av stark polaritet utfördes parallell jämförelsetest. En sepaflash C18 RP -flashkassett användes och blixtkromatogrammet för provet visades i figur 4. För regelbundna C18 -patroner är det högsta tolererade vattenfasförhållandet cirka 90%. Därför sattes startgradienten till 10% metanol i 90% vatten. Såsom visas i figur 4, på grund av den hydrofoba faskollapsen av C18 -kedjorna orsakade av högt vattenförhållande, behölls provet knappt på den vanliga C18 -patronen och eluerades direkt av den mobila fasen. Som ett resultat kan driften av provningsavsaltning eller rening inte slutföras.
Figur 4. Flash -kromatogrammet för provet på en regelbunden C18 -patron.
Jämförelse med linjär gradient har användningen av steggradient följande fördelar:
1. Lösningsanvändning och körtid för provrening reduceras.
2. Målprodukten eluteras i en skarp topp, vilket minskar volymen av insamlade fraktioner och underlättar således följande roterande avdunstning samt sparande tid.
3. Den insamlade produkten är i metanol som är lätt att förångas, vilket torktiden reduceras.
Sammanfattningsvis, för rening av provet som är starkt polärt eller mycket hydrofil, kan sepaflash C18AQ RP flashpatroner som kombinerar med det preparativa flashkromatografisystemet SEPABEAN ™ -maskinen erbjuda en snabb och effektiv lösning.
Om SEPAFLASH Bonded Series C18 RP Flash -patroner
Det finns en serie av SEPAFLASH C18AQ RP Flash -patroner med olika specifikationer från Santai -teknik (som visas i tabell 2).
| Objektnummer | Kolumnstorlek | Flödeshastighet (ml/min) | Max.tryck (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabell 2. SEPAFLASH C18AQ RP Flash -patroner.
Förpackningsmaterial: Högeffektiv sfärisk C18 (AQ) -bundna kiseldioxid, 20-45 μm, 100 Å.
Logy (som visas i tabell 2).
Posttid: aug 27-2018