Хонгцхенг Ванг, Бо Ксу
Центар за истраживање и развој апликација
Увод
Према релативним поларитетима стационарне фазе и мобилне фазе, течна хроматографија се може поделити на хроматографију нормалне фазе (НПЦ) и хроматографију реверзне фазе (РПЦ).За РПЦ, поларитет мобилне фазе је јачи од поларитета стационарне фазе.РПЦ је постао најраспрострањенији у режимима одвајања течне хроматографије због своје високе ефикасности, добре резолуције и јасног механизма задржавања.Због тога је РПЦ погодан за одвајање и пречишћавање различитих поларних или неполарних једињења, укључујући алкалоиде, угљене хидрате, масне киселине, стероиде, нуклеинске киселине, аминокиселине, пептиде, протеине, итд. У РПЦ, најчешће коришћена стационарна фаза је матрикс силика гела који је везан за различите функционалне групе, укључујући Ц18, Ц8, Ц4, фенил, цијано, амино, итд. Међу овим везаним функционалним групама, најшире коришћена је Ц18.Процењује се да више од 80% РПЦ-а сада користи Ц18 повезану фазу.Стога је Ц18 колона за хроматографију постала неопходна универзална колона за сваку лабораторију.
Иако се Ц18 колона може користити у веома широком спектру апликација, међутим, за неке узорке који су веома поларни или високо хидрофилни, обичне Ц18 колоне могу имати проблема када се користе за пречишћавање таквих узорака.У РПЦ, уобичајено коришћени растварачи за елуирање могу се поредати према њиховом поларитету: вода < метанол < ацетонитрил < етанол < тетрахидрофуран < изопропанол.Да би се обезбедило добро задржавање на колони за ове узорке (јако поларне или високо хидрофилне), висок удео воденог система је неопходан да се користи као мобилна фаза.Међутим, када се користи систем чисте воде (укључујући чисту воду или чист раствор соли) као мобилну фазу, дуги угљенични ланац на стационарној фази Ц18 колоне тежи да избегава воду и да се меша један са другим, што доводи до тренутног смањења капацитет задржавања колоне или чак никакво задржавање.Овај феномен се назива „хидрофобни фазни колапс“ (као што је приказано у левом делу слике 1).Иако је ова ситуација реверзибилна када се колона опере органским растварачима као што су метанол или ацетонитрил, она и даље може да изазове оштећење колоне.Због тога је неопходно спречити да се ова ситуација догоди.
Слика 1. Шематски дијаграм везаних фаза на површини силика гела у редовној Ц18 колони (лево) и Ц18АК колони (десно).
Да би решили горе поменуте проблеме, произвођачи хроматографских материјала за паковање су направили техничка побољшања.Једно од ових побољшања је прављење неких модификација на површини матрице силицијум диоксида, као што је увођење хидрофилних цијано група (као што је приказано у десном делу слике 1), како би се површина силика гела учинила хидрофилнијом.Тако би се ланци Ц18 на површини силицијум диоксида могли у потпуности проширити у високо воденим условима и могао би се избећи колапс хидрофобне фазе.Ове модификоване Ц18 колоне се називају водене Ц18 колоне, односно Ц18АК колоне, које су дизајниране за високо водене услове елуирања и могу толерисати 100% водени систем.Ц18АК колоне се широко примењују у одвајању и пречишћавању јаких поларних једињења, укључујући органске киселине, пептиде, нуклеозиде и витамине растворљиве у води.
Одсољавање је једна од типичних примена Ц18АК колона у флеш пречишћавању узорака, која уклања со или компоненте пуфера у растварачу узорка како би се олакшала примена узорка у наредним студијама.У овом посту, Бриллиант Блуе ФЦФ са јаким поларитетом је коришћен као узорак и пречишћен на Ц18АК колони.Растварач узорка је замењен органским растварачем из пуферског раствора, чиме је олакшано следеће ротационо испаравање, као и уштеда растварача и радног времена.Штавише, чистоћа узорка је побољшана уклањањем неких нечистоћа у узорку.
Експериментална Секција
Слика 2. Хемијска структура узорка.
Бриллиант Блуе ФЦФ је коришћен као узорак у овом посту.Чистоћа сировог узорка била је 86%, а хемијска структура узорка је приказана на слици 2. Да би се припремио раствор узорка, 300 мг прашкасте сирове чврсте супстанце Бриллиант Блуе ФЦФ је растворено у 1 М пуферском раствору НаХ2ПО4 и добро протресено да би постало потпуно јасно решење.Раствор узорка је затим убризган у флеш колону помоћу ињектора.Експериментална поставка флеш пречишћавања наведена је у табели 1.
| Инструмент | СепаБеан™ машина2 | |||
| Кертриџи | 12 г СепаФласх Ц18 РП флеш кертриџ (сферични силицијум диоксид, 20 - 45 μм, 100 А, број поруџбине: СВ-5222-012-СП) | 12 г СепаФласх Ц18АК РП флеш кертриџ (сферични силицијум диоксид, 20 - 45 μм, 100 А, број поруџбине: СВ-5222-012-СП(АК)） | ||
| Таласна дужина | 254 нм | |||
| Мобилна фаза | Растварач А: вода Растварач Б: метанол | |||
| Проток | 30 мЛ/мин | |||
| Учитавање узорка | 300 мг (Бриллиант Блуе ФЦФ са чистоћом од 86%) | |||
| Градијент | време (ЦВ) | Растварач Б (%) | време (ЦВ) | Растварач Б (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Резултати и дискусија
СепаФласх Ц18АК РП флеш кертриџ је коришћен за одсољавање и пречишћавање узорака.Коришћен је степенасти градијент у коме је чиста вода коришћена као мобилна фаза на почетку елуирања и коришћена је 10 запремина колоне (ЦВ).Као што је приказано на слици 3, када се користи чиста вода као мобилна фаза, узорак је у потпуности задржан на флеш кертриџу.Затим је метанол у мобилној фази директно повећан на 100% и градијент је одржаван за 7,5 ЦВ.Узорак је елуиран од 11,5 до 13,5 ЦВ.У сакупљеним фракцијама, раствор узорка је замењен из пуферског раствора НаХ2ПО4 метанолом.У поређењу са високо воденим раствором, метанол је било много лакше уклонити ротационим испаравањем у следећем кораку, што олакшава следећа истраживања.
Слика 3. Флеш хроматограм узорка на Ц18АК кертриџу.
Да би се упоредило понашање задржавања Ц18АК кертриџа и обичног Ц18 кертриџа за узорке јаког поларитета, урађен је тест паралелног поређења.Коришћен је СепаФласх Ц18 РП флеш кертриџ и флеш хроматограм за узорак је приказан на слици 4. За обичне Ц18 кертриџе, највећи толерисани однос водене фазе је око 90%.Због тога је почетни градијент постављен на 10% метанола у 90% воде.Као што је приказано на слици 4, услед колапса хидрофобне фазе ланаца Ц18 изазваног високим воденим односом, узорак се једва задржао на обичном Ц18 кертриџу и директно је елуиран мобилном фазом.Као резултат, операција одсољавања или пречишћавања узорака не може да се заврши.
Слика 4. Фласх хроматограм узорка на обичном Ц18 кертриџу.
У поређењу са линеарним градијентом, употреба степенастог градијента има следеће предности:
1. Смањује се употреба растварача и време рада за пречишћавање узорка.
2. Циљни производ елуира у оштром врху, што смањује запремину сакупљених фракција и на тај начин олакшава следеће ротационо испаравање као и уштеду времена.
3. Сакупљени производ је у метанолу који се лако испарава, чиме се смањује време сушења.
У закључку, за пречишћавање узорка који је јако поларан или високо хидрофилан, СепаФласх Ц18АК РП флеш кертриџи у комбинацији са препаративном флеш хроматографијом СепаБеан™ Мацхине могу понудити брзо и ефикасно решење.
О флеш кертриџима СепаФласх Бондед Ц18 РП
Постоји серија СепаФласх Ц18АК РП флеш кертриџа са различитим спецификацијама компаније Сантаи Тецхнологи (као што је приказано у табели 2).
| Број предмета | Величина колоне | Проток (мЛ/мин) | Мак.Прессуре (пси/бар) |
| СВ-5222-004-СП(АК) | 5,4 г | 5-15 | 400/27.5 |
| СВ-5222-012-СП(АК) | 20 г | 10-25 | 400/27.5 |
| СВ-5222-025-СП(АК) | 33 г | 10-25 | 400/27.5 |
| СВ-5222-040-СП(АК) | 48 г | 15-30 | 400/27.5 |
| СВ-5222-080-СП(АК) | 105 г | 25-50 | 350/24.0 |
| СВ-5222-120-СП(АК) | 155 г | 30-60 | 300/20.7 |
| СВ-5222-220-СП(АК) | 300 г | 40-80 | 300/20.7 |
| СВ-5222-330-СП(АК) | 420 г | 40-80 | 250/17.2 |
Табела 2. СепаФласх Ц18АК РП флеш кертриџи.
Материјали за паковање: Високоефикасни сферни силицијум-диоксид повезан са Ц18(АК), 20 - 45 μм, 100 А.
логија (као што је приказано у табели 2).
Време објаве: 27.08.2018