Hongcheng Wang, Bo Xu
Qendra e Kërkimit dhe Zhvillimit të Aplikimit
Prezantimi
Sipas polariteteve relative të fazës stacionare dhe të fazës së lëvizshme, kromatografia e lëngshme mund të ndahet në kromatografi me fazë normale (NPC) dhe kromatografi të fazës së kundërt (RPC).Për RPC, polariteti i fazës së lëvizshme është më i fortë se ai i fazës stacionare.RPC është bërë më i përdoruri në mënyrat e ndarjes së kromatografisë së lëngshme për shkak të efikasitetit të lartë, rezolucionit të mirë dhe mekanizmit të mbajtjes së qartë.Prandaj RPC është i përshtatshëm për ndarjen dhe pastrimin e komponimeve të ndryshme polare ose jopolare, duke përfshirë alkaloidet, karbohidratet, acidet yndyrore, steroidet, acidet nukleike, aminoacidet, peptidet, proteinat, etj. Në RPC, faza stacionare më e përdorur është matrica e xhelit silicë e cila është e lidhur me grupe të ndryshme funksionale, duke përfshirë C18, C8, C4, fenil, ciano, amino, etj. Ndër këto grupe funksionale të lidhura, më i përdoruri është C18.Është vlerësuar se më shumë se 80% e RPC tani po përdorin fazën e lidhjes C18.Prandaj, kolona e kromatografisë C18 është bërë një kolonë universale e domosdoshme për çdo laborator.
Megjithëse kolona C18 mund të përdoret në një gamë shumë të gjerë aplikimesh, megjithatë, për disa mostra që janë shumë polare ose shumë hidrofile, kolonat e rregullta C18 mund të kenë probleme kur përdoren për të pastruar mostra të tilla.Në RPC, tretësit e elucionit të përdorur zakonisht mund të renditen sipas polaritetit të tyre: ujë < metanol < acetonitril < etanol < tetrahidrofuran < izopropanol.Për të siguruar mbajtje të mirë në kolonë për këto mostra (polare të forta ose shumë hidrofile), një përqindje e lartë e sistemit ujor është e nevojshme të përdoret si fazë e lëvizshme.Megjithatë, kur përdoret sistemi i ujit të pastër (përfshirë ujin e pastër ose tretësirën e pastër të kripës) si fazë lëvizëse, zinxhiri i gjatë i karbonit në fazën e palëvizshme të kolonës C18 tenton të shmangë ujin dhe të përzihet me njëri-tjetrin, duke rezultuar në një ulje të menjëhershme të kapaciteti mbajtës i kolonës ose edhe pa mbajtje.Ky fenomen quhet "kolapsi i fazës hidrofobike" (siç tregohet në pjesën e majtë të figurës 1).Megjithëse kjo situatë është e kthyeshme kur kolona lahet me tretës organikë si metanol ose acetonitril, megjithatë mund të shkaktojë dëmtim të kolonës.Prandaj, është e nevojshme të parandaloni që kjo situatë të ndodhë.
Figura 1. Diagrami skematik i fazave të lidhura në sipërfaqen e xhelit silicë në kolonën e rregullt C18 (majtas) dhe kolonën C18AQ (djathtas).
Për të adresuar problemet e lartpërmendura, prodhuesit e materialeve të paketimit kromatografik kanë bërë përmirësime teknike.Një nga këto përmirësime është kryerja e disa modifikimeve në sipërfaqen e matricës së silicës, siç është futja e grupeve hidrofile ciano (siç tregohet në pjesën e djathtë të figurës 1), për ta bërë sipërfaqen e xhelit të silicës më hidrofile.Kështu zinxhirët C18 në sipërfaqen e silicës mund të zgjerohen plotësisht në kushte shumë ujore dhe mund të shmanget kolapsi i fazës hidrofobike.Këto kolona të modifikuara C18 quhen kolona ujore C18, përkatësisht kolona C18AQ, të cilat janë të dizajnuara për kushte elucioni me shumë ujë dhe mund të tolerojnë një sistem ujor 100%.Kolonat C18AQ janë aplikuar gjerësisht në ndarjen dhe pastrimin e përbërjeve të forta polare, duke përfshirë acidet organike, peptidet, nukleozidet dhe vitaminat e tretshme në ujë.
Çkriposja është një nga aplikimet tipike të kolonave C18AQ në pastrimin flash për mostrat, i cili heq kripën ose përbërësit tampon në tretësin e mostrës për të lehtësuar aplikimin e kampionit në studimet e mëvonshme.Në këtë postim, Brilliant Blue FCF me polaritet të fortë u përdor si mostër dhe u pastrua në kolonën C18AQ.Tretësi i mostrës u zëvendësua me tretës organik nga tretësira tampon, duke lehtësuar kështu avullimin rrotullues të mëposhtëm si dhe kursimin e tretësve dhe kohës së funksionimit.Për më tepër, pastërtia e kampionit u përmirësua duke hequr disa papastërti në kampion.
Seksioni Eksperimental
Figura 2. Struktura kimike e kampionit.
Brilliant Blue FCF u përdor si mostër në këtë postim.Pastërtia e kampionit të papërpunuar ishte 86% dhe struktura kimike e kampionit u tregua në Figurën 2. Për të përgatitur tretësirën e mostrës, 300 mg e ngurtë pluhur i papërpunuar i Brilliant Blue FCF u shpërnda në tretësirë tampon NaH2PO4 1 M dhe u tund mirë për t'u bërë një zgjidhje plotësisht e qartë.Zgjidhja e mostrës më pas u injektua në kolonën flash me një injektor.Konfigurimi eksperimental i pastrimit flash është renditur në Tabelën 1.
| Instrumenti | Makina SepaBean™2 | |||
| fishekë | 12 g fishek flash SepaFlash C18 RP (silicë sferike, 20 - 45 μm, 100 Å, Numri i porosisë: SW-5222-012-SP) | 12 g fishek flash SepaFlash C18AQ RP (silicë sferike, 20 - 45 μm, 100 Å, numri i porosisë:SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Gjatësia e valës | 254 nm | |||
| Faza e lëvizshme | Tretësi A: Ujë Tretësi B: Metanol | |||
| Shkalla e rrjedhjes | 30 ml/min | |||
| Ngarkimi i mostrës | 300 mg (Brilliant Blue FCF me pastërtinë 86%) | |||
| Gradient | Koha (CV) | Tretësi B (%) | Koha (CV) | Tretësi B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultate dhe diskutime
Një fishek flash SepaFlash C18AQ RP u përdor për shkripëzimin dhe pastrimin e mostrës.U përdor gradienti i hapit në të cilin uji i pastër u përdor si faza e lëvizshme në fillim të elucionit dhe u përdor për 10 vëllime kolone (CV).Siç tregohet në figurën 3, kur përdoret uji i pastër si fazë lëvizëse, kampioni u mbajt plotësisht në fishekun flash.Më pas, metanoli në fazën e lëvizshme u rrit drejtpërdrejt në 100% dhe gradienti u mbajt për 7.5 CV.Mostra u elua nga 11.5 në 13.5 CV.Në fraksionet e mbledhura, tretësira e mostrës u zëvendësua nga tretësira tampon NaH2PO4 në metanol.Krahasuar me tretësirën shumë ujore, metanoli ishte shumë më i lehtë për t'u hequr nga avullimi rrotullues në hapin pasues, gjë që lehtëson kërkimin e mëposhtëm.
Figura 3. Kromatogrami flash i kampionit në një fishek C18AQ.
Për të krahasuar sjelljen e mbajtjes së fishekut C18AQ dhe fishekut të rregullt C18 për mostrat me polaritet të fortë, u krye testi krahasues paralel.Është përdorur një fishek flash SepaFlash C18 RP dhe kromatogrami flash për kampionin është paraqitur në Figurën 4. Për fishekët e rregullt C18, raporti më i lartë i toleruar i fazës ujore është rreth 90%.Prandaj, gradienti fillestar u vendos në 10% metanol në 90% ujë.Siç tregohet në figurën 4, për shkak të kolapsit të fazës hidrofobike të zinxhirëve C18 të shkaktuar nga raporti i lartë ujor, kampioni mezi u mbajt në fishekun e rregullt C18 dhe u elua drejtpërdrejt nga faza e lëvizshme.Si rezultat, operacioni i shkripëzimit ose pastrimit të mostrës nuk mund të përfundojë.
Figura 4. Kromatogrami flash i kampionit në një fishek të rregullt C18.
Krahasuar me gradientin linear, përdorimi i gradientit të hapit ka përparësitë e mëposhtme:
1. Përdorimi i tretësit dhe koha e funksionimit për pastrimin e mostrës është zvogëluar.
2. Produkti i synuar elutet në një kulm të mprehtë, i cili redukton volumin e fraksioneve të mbledhura dhe kështu lehtëson avullimin rrotullues të mëposhtëm si dhe kursen kohë.
3. Produkti i grumbulluar është në metanol i cili avullohet lehtë, kështu që koha e tharjes zvogëlohet.
Si përfundim, për pastrimin e kampionit që është shumë polare ose shumë hidrofile, fishekët flash SepaFlash C18AQ RP të kombinuara me sistemin përgatitor të kromatografisë flash SepaBean™ Machine mund të ofrojnë një zgjidhje të shpejtë dhe efikase.
Rreth fishekëve flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Ekzistojnë një seri fishekësh flash SepaFlash C18AQ RP me specifika të ndryshme nga teknologjia Santai (siç tregohet në Tabelën 2).
| Numri i artikullit | Madhësia e kolonës | Shkalla e rrjedhjes (mL/min) | Maksimumi.Presioni (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabela 2. Fishekët flash SepaFlash C18AQ RP.
Materialet e paketimit: silicë sferike me lidhje C18(AQ) me efikasitet të lartë, 20 - 45 μm, 100 Å.
logjika (siç tregohet në tabelën 2).
Koha e postimit: Gusht-27-2018