Hongcheng Wang, Bo Xu
Aplikimi R&D Center
Prezantim
Sipas polariteteve relative të fazës së palëvizshme dhe fazës së lëvizshme, kromatografia e lëngshme mund të ndahet në kromatografinë e fazës normale (NPC) dhe kromatografinë e fazës së përmbysur (RPC). Për RPC, polariteti i fazës së lëvizshme është më e fortë se ajo e fazës së palëvizshme. RPC është bërë ajo më e përdorur gjerësisht në mënyrat e ndarjes së kromatografisë së lëngshme për shkak të efikasitetit të lartë, zgjidhjes së mirë dhe mekanizmit të qartë të mbajtjes. Prandaj RPC është e përshtatshme për ndarjen dhe pastrimin e komponimeve të ndryshme polare ose jo polare, duke përfshirë alkaloide, karbohidrate, acide yndyrore, steroide, acide nukleike, aminoacide, peptide, proteina, etj. Amino, etj. Ndër këto grupe funksionale të lidhura, ai më i përdorur është C18. Vlerësohet se më shumë se 80% e RPC tani po përdorin fazën e lidhur C18. Prandaj kolona e kromatografisë C18 është bërë një kolonë universale e domosdoshme për çdo laborator.
Megjithëse kolona C18 mund të përdoret në një gamë shumë të gjerë të aplikacioneve, megjithatë, për disa mostra që janë shumë polare ose shumë hidrofile, kolonat e rregullta C18 mund të kenë probleme kur përdoren për të pastruar mostra të tilla. Në RPC, tretësit e zgjatur të përdorur zakonisht mund të porositen sipas polaritetit të tyre: uji <metanol <acetonitrile <etanol <tetrahidrofuran <izopropanol. Për të siguruar mbajtje të mirë në kolonën për këto mostra (polare të forta ose shumë hidrofile), proporcion i lartë i sistemit ujor është e nevojshme të përdoret si faza e lëvizshme. Sidoqoftë, kur përdorni sistemin e ujit të pastër (përfshirë ujin e pastër ose zgjidhjen e kripës së pastër) si fazë të lëvizshme, zinxhiri i gjatë i karbonit në fazën e palëvizshme të kolonës C18 ka tendencë të shmangë ujin dhe të përzihet me njëri -tjetrin, duke rezultuar në një ulje të menjëhershme të kapacitetit të mbajtjes së kolonës ose madje edhe pa mbajtje. Ky fenomen quhet "kolapsi i fazës hidrofobike" (siç tregohet në pjesën e majtë të figurës 1). Megjithëse kjo situatë është e kthyeshme kur kolona lahet me tretës organikë si metanol ose acetonitril, ajo ende mund të shkaktojë dëme në kolonë. Prandaj, është e nevojshme të parandalohet që kjo situatë të ndodhë.
Figura 1. Diagrami skematik i fazave të lidhura në sipërfaqen e xhelit silicë në kolonën e rregullt C18 (majtas) dhe kolonën C18AQ (djathtas).
Për të adresuar problemet e lartpërmendura, prodhuesit e materialeve të paketimit kromatografik kanë bërë përmirësime teknike. Një nga këto përmirësime është bërja e disa modifikimeve në sipërfaqen e matricës së silicës, siç është futja e grupeve ciano hidrofile (siç tregohet në pjesën e duhur të figurës 1), për ta bërë sipërfaqen e xhelit silicë më hidrofil. Kështu që zinxhirët C18 në sipërfaqen e silicës mund të shtrihen plotësisht në kushte shumë ujore dhe mund të shmanget shembja e fazës hidrofobike. Këto kolona të modifikuara C18 quhen kolona ujore C18, përkatësisht kolonat C18AQ, të cilat janë të dizajnuara për kushte të zgjatjes shumë ujore dhe mund të tolerojnë sistemin ujor 100%. Kolonat C18AQ janë aplikuar gjerësisht në ndarjen dhe pastrimin e komponimeve të forta polare, duke përfshirë acidet organike, peptidet, nukleozidet dhe vitaminat e tretshme në ujë.
Desalting është një nga aplikimet tipike të kolonave C18AQ në pastrimin e flashit për mostrat, i cili heq përbërësit e kripës ose tamponit në tretësin e mostrës për të lehtësuar aplikimin e mostrës në studimet pasuese. Në këtë post, FCF e shkëlqyeshme blu me polaritet të fortë u përdor si mostra dhe u pastrua në kolonën C18AQ. Tretësira e mostrës u zëvendësua me tretës organik nga zgjidhja tampon, duke lehtësuar kështu avullimin rrotullues të mëposhtëm, si dhe duke kursyer tretës dhe kohë operimi. Për më tepër, pastërtia e mostrës u përmirësua duke hequr disa papastërti në mostër.
Seksion eksperimental
Figura 2. Struktura kimike e mostrës.
FCF e shkëlqyeshme blu u përdor si mostra në këtë post. Pastërtia e mostrës së papërpunuar ishte 86% dhe struktura kimike e mostrës u tregua në Figurën 2. Për të përgatitur zgjidhjen e mostrës, 300 mg të ngurtë të papërpunuar pluhur të Brilliant Blue FCF u tret në 1 m zgjidhje tampon NAH2PO4 dhe u trondit mirë për t'u bërë një zgjidhje plotësisht e qartë. Zgjidhja e mostrës u injektua më pas në kolonën Flash nga një injeksion. Vendosja eksperimentale e pastrimit të flashit është renditur në Tabelën 1.
| Instrument | Makinë Sepabean2 | |||
| Fishekë | 12 g Sepaflash C18 RP Flash Flash (silicë sferike, 20-45 μm, 100 Å, Numri i Rendit: SW-5222-012-SP) | 12 g Sepaflash C18AQ RP Flash Flash (silicë sferike, 20-45 μm, 100 Å, Numri i Rendit ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Gjatësi vale | 254 nm | |||
| Faza e lëvizshme | Tretës a ： Uji Tretës b ： metanol | |||
| Normë e rrjedhës | 30 ml/min | |||
| Mostra e ngarkimit | 300 mg (FCF e shkëlqyeshme blu me pastërtinë prej 86%) | |||
| Gradient | Koha (CV) | Tretës b (%) | Koha (CV) | Tretës b (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultatet dhe diskutimi
Një fishek SEPAFLASH C18AQ RP Flash u përdor për shkrepje dhe pastrim të mostrës. Gradient hapi u përdor në të cilin u përdor uji i pastër si faza e lëvizshme në fillim të elution dhe ekzekutoi për 10 vëllime kolonash (CV). Siç tregohet në Figurën 3, kur përdorni ujë të pastër si faza e lëvizshme, mostra u mbajt plotësisht në fishekun flash. Tjetra, metanoli në fazën e lëvizshme u rrit drejtpërdrejt në 100% dhe gradienti u mbajt për 7.5 cv. Mostra u zgjodh nga 11.5 në 13.5 cv. Në fraksionet e mbledhura, zgjidhja e mostrës u zëvendësua nga zgjidhja tampon NAH2PO4 në metanol. Duke e krahasuar me tretësirë shumë ujore, metanoli ishte shumë më i lehtë për t'u hequr nga avullimi rrotullues në hapin pasues, i cili lehtëson hulumtimin e mëposhtëm.
Figura 3. Kromatogrami flash të mostrës në një fishek C18AQ.
Për të krahasuar sjelljen e mbajtjes së fishekut C18AQ dhe fishekë të rregullt C18 për mostra të polaritetit të fortë, u krye testi i krahasimit paralel. U përdor një fishek Flash Sepaflash C18 RP dhe kromatogrami flash për mostrën u tregua në Figurën 4. Për fishekë të rregullt C18, raporti më i lartë i fazës ujore të toleruar është rreth 90%. Prandaj, gradienti i fillimit u vendos në 10% metanol në 90% ujë. Siç tregohet në Figurën 4, për shkak të rrëzimit të fazës hidrofobike të zinxhirëve C18 të shkaktuar nga raporti i lartë ujor, mostra mezi u mbajt në fishekun e rregullt C18 dhe u zgjodh drejtpërdrejt nga faza e lëvizshme. Si rezultat, funksionimi i desalting ose pastrimit të mostrës nuk mund të përfundojë.
Figura 4. Kromatogrami Flash i mostrës në një fishek të rregullt C18.
Duke krahasuar me gradientin linear, përdorimi i gradientit hap ka avantazhet e mëposhtme:
1. Përdorimi i tretësit dhe koha e drejtimit për pastrimin e mostrës është zvogëluar.
2. Produkti i synuar elën në një kulm të mprehtë, i cili zvogëlon vëllimin e fraksioneve të mbledhura dhe kështu lehtëson avullimin e mëposhtëm rrotullues, si dhe kursimin e kohës.
3. Produkti i mbledhur është në metanol i cili është i lehtë për tu avulluar, kështu që koha e tharjes është zvogëluar.
Si përfundim, për pastrimin e mostrës i cili është fuqimisht polar ose shumë hidrofil, Sepaflash C18AQ RP Flash Flash Flash duke u kombinuar me sistemin e kromatografisë flash përgatitore Makinë Sepabean ™ mund të ofrojë një zgjidhje të shpejtë dhe efikase.
Rreth Serisë Sepaflash të lidhura C18 RP Flash Flashges
Ekzistojnë një seri e fishekëve flash të Sepaflash C18AQ RP me specifikime të ndryshme nga teknologjia Santai (siç tregohet në Tabelën 2).
| Numri i artikullit | Madhësia e kolonës | Normë e rrjedhës (ml/min) | Presion maksimal (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 G | 40-80 | 250/17.2 |
Tabela 2. Sepaflash C18AQ RP Flash Flash.
Materialet e paketimit: me efikasitet të lartë sferik C18 (AQ)-silicë të ndërtuar, 20-45 μm, 100.
logy (siç tregohet në Tabelën 2).
Koha e postimit: Gusht-27-2018