Rui Huang, Bo Xu
Center za raziskave in razvoj aplikacij
Uvod
Peptid je spojina, sestavljena iz aminokislin, od katerih ima vsaka edinstvene fizikalne in kemijske lastnosti zaradi različnih vrst in vrstnega reda aminokislinskih ostankov, ki tvorijo njeno zaporedje.Z razvojem kemične sinteze v trdni fazi je kemična sinteza različnih aktivnih peptidov močno napredovala.Zaradi zapletene sestave peptida, pridobljenega s sintezo v trdni fazi, je treba končni produkt očistiti z zanesljivimi metodami ločevanja.Običajno uporabljene metode čiščenja peptidov vključujejo ionsko izmenjevalno kromatografijo (IEC) in tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (RP-HPLC) z reverzno fazo, katerih pomanjkljivosti so nizka zmogljivost nalaganja vzorcev, visoki stroški medijev za ločevanje, zapletena in draga oprema za ločevanje, itd. Za hitro čiščenje peptidov z majhnimi molekulami (MW < 1 kDa) je Santai Technologies predhodno objavil uspešen primer uporabe, v katerem je bila uporabljena kartuša SepaFlash RP C18 za hitro čiščenje timopentina (TP-5) in pridobljen ciljni izdelek, ki ustreza zahtevam.
Slika 1. 20 pogostih aminokislin (povzeto iz www.bachem.com).
Obstaja 20 vrst aminokislin, ki so pogoste v sestavi peptidov.Te aminokisline lahko razdelimo v naslednje skupine glede na njihovo polarnost in kislinsko-bazično lastnost: nepolarne (hidrofobne), polarne (nenaelektrene), kisle ali bazične (kot je prikazano na sliki 1).Če so v peptidnem zaporedju aminokisline, ki sestavljajo zaporedje, večinoma polarne (kot so označene z rožnato barvo na sliki 1), kot so cistein, glutamin, asparagin, serin, treonin, tirozin itd., potem ima lahko ta peptid močan polarnost in biti dobro topen v vodi.Med postopkom čiščenja teh močnih vzorcev polarnih peptidov s kromatografijo z reverzno fazo bo prišlo do pojava, imenovanega kolaps hidrofobne faze (glejte predhodno objavljeno opombo o uporabi podjetja Santai Technologies: kolaps hidrofobne faze, kolone za kromatografijo reverzne faze AQ in njihove aplikacije).V primerjavi z običajnimi kolonami C18 so izboljšane kolone C18AQ najprimernejše za čiščenje močnih polarnih ali hidrofilnih vzorcev.V tej objavi je bil kot vzorec uporabljen močan polarni peptid in prečiščen s kolono C18AQ.Kot rezultat je bil pridobljen ciljni izdelek, ki izpolnjuje zahteve in se lahko uporablja v naslednjih raziskavah in razvoju.
| Instrument | SepaBean™stroj 2 | |||
| Kartuše | 12 g bliskovni vložek SepaFlash C18 RP (sferični silicijev dioksid, 20–45 μm, 100 Å, številka naročila: SW-5222-012-SP) | 12 g bliskovni vložek SepaFlash C18AQ RP (sferični silicijev dioksid, 20–45 μm, 100 Å, številka naročila: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Valovna dolžina | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobilna faza | Topilo A: Voda Topilo B: acetonitril | |||
| Pretok | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Nalaganje vzorca | 30 mg | |||
| Gradient | Čas (CV) | Topilo B (%) | čas (min) | Topilo B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Rezultati in razprava
Za primerjavo učinkovitosti čiščenja za vzorec polarnega peptida med navadno kolono C18 in kolono C18AQ smo za začetek uporabili navadno kolono C18 za hitro čiščenje vzorca.Kot je prikazano na sliki 2, se je zaradi kolapsa hidrofobne faze verig C18, ki ga povzroča visoko vodno razmerje, vzorec komaj obdržal na navadnem vložku C18 in ga je neposredno eluirala mobilna faza.Posledično vzorec ni bil učinkovito ločen in prečiščen.
Slika 2. Flash kromatogram vzorca na običajni kartuši C18.
Nato smo uporabili kolono C18AQ za hitro čiščenje vzorca.Kot je prikazano na sliki 3, je bil peptid učinkovito zadržan na koloni in nato eluiran.Ciljni produkt smo ločili od nečistoč v surovem vzorcu in zbrali.Po liofilizaciji in nato analizi s HPLC ima očiščen produkt čistost 98,2 % in ga je mogoče nadalje uporabiti za naslednje korake raziskav in razvoja.
Slika 3. Flash kromatogram vzorca na kartuši C18AQ.
Za zaključek, bliskovna kartuša SepaFlash C18AQ RP v kombinaciji s sistemom bliskovne kromatografije SepaBean™stroj bi lahko ponudil hitro in učinkovito rešitev za čiščenje močnih polarnih ali hidrofilnih vzorcev.
Obstaja serija bliskovnih kartuš SepaFlash C18AQ RP z različnimi specifikacijami podjetja Santai Technology (kot je prikazano v tabeli 2).
| Številka artikla | Velikost stolpca | Pretok (mL/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabela 2. SepaFlash C18AQ RP bliskovne kartuše.Embalažni materiali: Visoko učinkovit sferični C18(AQ) vezan silicijev dioksid, 20–45 μm, 100 Å.
Za nadaljnje informacije o podrobnih specifikacijah naprave SepaBean™ ali informacije o naročanju bliskovnih kartuš serije SepaFlash obiščite našo spletno stran.
Čas objave: 12. oktober 2018