Hongcheng Wang, Bo Xu
Center za raziskave in razvoj
Uvod
Glede na relativne polarnosti stacionarne in mobilne faze lahko tekoča kromatografija razdelimo na normalno fazno kromatografijo (NPC) in obrnjeno fazno kromatografijo (RPC). Za RPC je polarnost mobilne faze močnejša od stacionarne faze. RPC je zaradi visoke učinkovitosti, dobre ločljivosti in jasnega zadrževalnega mehanizma postal najpogosteje uporabljen pri načinih ločevanja tekočine kromatografije. Therefore RPC is suitable for the separation and purification of various polar or non-polar compounds, including alkaloids, carbohydrates, fatty acids, steroids, nucleic acids, amino acids, peptides, proteins, etc. In RPC, the most commonly used stationary phase is the silica gel matrix which is bonded with various functional groups, including C18, C8, C4, phenyl, cyano, amino itd. Med temi vezanimi funkcionalnimi skupinami je najbolj uporabljena ena C18. Ocenjujejo, da več kot 80% RPC zdaj uporablja fazo, povezano s C18. Zato je kromatografija C18 postala obvezen univerzalni stolpec za vsak laboratorij.
Čeprav se stolpec C18 lahko uporablja v zelo širokem razponu aplikacij, pa lahko pri nekaterih vzorcih, ki so zelo polarni ali zelo hidrofilni, imajo redni stolpci C18 težave pri uporabi za čiščenje takšnih vzorcev. V RPC lahko pogosto uporabljena topila za elucijo naročimo glede na njihovo polarnost: voda <metanol <acetonitril <etanol <tetrahidrofuran <izopropanol. Za zagotovitev dobrega zadrževanja na stolpcu za te vzorce (močan polarni ali zelo hidrofilni) je potreben velik delež vodnega sistema, ki ga je treba uporabiti kot mobilno fazo. Vendar pa pri uporabi čiste vode (vključno s čisto vodo ali raztopino čiste soli) kot mobilno fazo, dolga ogljikova veriga na nepremični fazi stolpca C18 se izogne vodi in se med seboj meša, kar ima za posledico takojšnjo zmanjšanje zadrževalne zmogljivosti stolpca ali celo zadrževanje. Ta pojav se imenuje "hidrofobni fazni propad" (kot je prikazano na levem delu slike 1). Čeprav je ta situacija reverzibilna, ko se kolona opere z organskimi topili, kot sta metanol ali acetonitril, lahko še vedno povzroči poškodbe stolpca. Zato je treba preprečiti, da bi se ta situacija zgodila.
Slika 1. Shematski diagram vezanih faz na površini silikagela v običajnem stolpcu C18 (levo) in stolpcu C18AQ (desno).
Za reševanje zgoraj omenjenih težav so proizvajalci kromatografskih embalažnih materialov naredili tehnične izboljšave. Ena od teh izboljšav je nekaj sprememb na površini matrice kremena, kot je vnos hidrofilnih ciano skupin (kot je prikazano na desnem delu slike 1), da bi bila površina silikagela bolj hidrofilna. Tako se lahko verige C18 na površini silicijevega dioksida v celoti iztegnejo v zelo vodnih pogojih in se izognemo hidrofobnemu faznemu propadu. Ti spremenjeni stolpci C18 se imenujejo vodni stolpci C18, in sicer stolpci C18AQ, ki so zasnovani za zelo vodne elucijske pogoje in lahko prenašajo 100% vodni sistem. Stolpci C18AQ so bili široko uporabljeni pri ločevanju in čiščenju močnih polarnih spojin, vključno z organskimi kislinami, peptidi, nukleozidi in vodotopnimi vitamini.
Razsoljanje je ena od značilnih aplikacij stolpcev C18AQ pri čiščenju bliskavice za vzorce, ki v vzorčnem topilu odstrani komponente soli ali pufra, da olajša uporabo vzorca v naslednjih študijah. V tej objavi je bil kot vzorec uporabljen briljantni modri FCF z močno polarnostjo in očiščen na stolpcu C18AQ. Vzorčno topilo je bilo nadomeščeno z organskim topilom iz puferske raztopine in tako olajšalo naslednje rotacijsko izhlapevanje, pa tudi reševanje topil in delovni čas. Poleg tega smo čistost vzorca izboljšali z odstranitvijo nekaterih nečistoč v vzorcu.
Eksperimentalni odsek
Slika 2. Kemična struktura vzorca.
Kot vzorec je bil v tej objavi uporabljen briljantni modri FCF. Čistost surovega vzorca je bila 86%, kemijska struktura vzorca pa je bila prikazana na sliki 2. Za pripravo raztopine vzorca smo 300 mg praškaste surove trdne snovi briljantno modrega FCF raztopili v 1 m nah2po4 pufer raztopine in se dobro pretresli, da postane popolnoma jasna raztopina. Raztopino vzorca smo nato injektor vbrizgali v bliskavico. Eksperimentalna nastavitev čiščenja bliskavice je navedena v tabeli 1.
| Instrument | Stroj Sepabean ™2 | |||
| Kartuše | 12 g sepaflash C18 RP Flash kartuša (sferični kremen, 20-45 μm, 100 Å, številka naročila: SW-5222-012-SP) | 12 g sepaflash C18AQ RP Flash kartuša (sferični kremen, 20-45 μm, 100 Å, številka naročila: SW-5222-012-SP (aq)） | ||
| Valovna dolžina | 254 nm | |||
| Mobilna faza | Topilo A: Voda Topilo B: Metanol | |||
| Pretok | 30 ml/min | |||
| Nalaganje vzorca | 300 mg (briljantno modri FCF s čistostjo 86%) | |||
| Gradient | Čas (cv) | Topilo B (%) | Čas (cv) | Topilo B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultati in razprava
Za razsutje in čiščenje vzorcev je bila uporabljena bliskovita kartuša SEPAFLASH C18AQ RP. Uporabljali smo gradient korakov, v katerem je bila čista voda uporabljena kot mobilna faza na začetku elucije in se zagnala za 10 količin stolpcev (CV). Kot je prikazano na sliki 3, je bil pri uporabi čiste vode kot mobilne faze vzorec v celoti zadržan na flash kartuši. Nato se je metanol v mobilni fazi neposredno povečal na 100%, gradient pa je bil vzdrževan za 7,5 cv. Vzorec je bil eluiran od 11,5 do 13,5 cv. V zbranih frakcijah smo vzorčno raztopino zamenjali iz puferne raztopine Nah2PO4 do metanola. V primerjavi z visoko vodno raztopino je bilo veliko lažje odstraniti z rotacijskim izhlapevanjem v naslednjem koraku, kar olajša naslednje raziskave.
Slika 3. Flash kromatogram vzorca na kartuši C18AQ.
Za primerjavo zadrževalnega vedenja kartuše C18AQ in redne kartuše C18 za vzorce močne polarnosti je bil izveden vzporedni primerjalni test. Uporabljena je bila flash kartuša za sepaflash C18 RP, bliskovni kromatogram za vzorec pa je prikazan na sliki 4. Za običajne kartuše C18 je najvišje tolerirano vodno fazno razmerje približno 90%. Zato je bil začetni gradient postavljen na 10% metanola v 90% vode. Kot je prikazano na sliki 4, je bil zaradi hidrofobnega faznega kolapsa verig C18, ki jih povzroča visoko vodno razmerje, vzorec komaj zadržan na običajni kartuši C18 in ga neposredno eluirala mobilna faza. Posledično delovanja razsutja ali čiščenja vzorcev ni mogoče dokončati.
Slika 4. Flash kromatogram vzorca na običajni kartuši C18.
V primerjavi z linearnim gradientom ima uporaba koračnega gradienta naslednje prednosti:
1. Uporaba topila in čas delovanja za čiščenje vzorcev se zmanjša.
2. Ciljni produkt se zniža v ostrem vrhuncu, kar zmanjšuje količino zbranih frakcij in tako olajša naslednje rotacijsko izhlapevanje in čas varčevanja.
3. Zbrani izdelek je v metanolu, ki ga je enostavno izhlapevati, zato se čas sušenja skrajša.
Za zaključek bi lahko za čiščenje vzorca, ki je močno polarni ali zelo hidrofilni, sepaflash C18AQ RP Flash kartuše v kombinaciji s pripravljalnim sistemom Flash kromatografije Sepabean ™ lahko ponudi hitro in učinkovito rešitev.
O seriji serije C18 RP Flash kartuš serije C18 RP.
Obstaja serija flash kartuš SEPAFLASH C18AQ RP z različnimi specifikacijami iz tehnologije Santai (kot je prikazano v tabeli 2).
| Številka predmeta | Velikost stolpca | Pretok (ml/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (aq) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabela 2. Sepaflash C18AQ RP Flash kartuše.
Pakirani materiali: sferični silicijev dioksid z visoko učinkovitostjo sferičnega C18 (aq), 20-45 μm, 100 Å.
Logija (kot je prikazano v tabeli 2).
Čas objave: avgust-27-2018