Hongcheng Wang, Bo Xu
Center za raziskave in razvoj aplikacij
Uvod
Glede na relativno polarnost stacionarne in mobilne faze lahko tekočinsko kromatografijo razdelimo na normalno fazno kromatografijo (NPC) in reverzno fazno kromatografijo (RPC).Pri RPC je polarnost mobilne faze močnejša od polarnosti stacionarne faze.RPC je zaradi visoke učinkovitosti, dobre ločljivosti in jasnega zadrževalnega mehanizma postal najpogosteje uporabljen v načinih ločevanja s tekočinsko kromatografijo.Zato je RPC primeren za ločevanje in čiščenje različnih polarnih ali nepolarnih spojin, vključno z alkaloidi, ogljikovimi hidrati, maščobnimi kislinami, steroidi, nukleinskimi kislinami, aminokislinami, peptidi, proteini itd. V RPC je najpogosteje uporabljena stacionarna faza matriko silikagela, ki je vezana z različnimi funkcionalnimi skupinami, vključno s C18, C8, C4, fenilom, ciano, amino itd. Med temi vezanimi funkcionalnimi skupinami je najbolj razširjena C18.Ocenjuje se, da več kot 80 % RPC zdaj uporablja vezano fazo C18.Zato je postala kromatografska kolona C18 univerzalna kolona, ki jo mora imeti vsak laboratorij.
Čeprav je kolono C18 mogoče uporabiti v zelo širokem spektru aplikacij, imajo lahko navadne kolone C18 težave pri nekaterih vzorcih, ki so zelo polarni ali zelo hidrofilni, pri uporabi za čiščenje takih vzorcev.V RPC lahko običajno uporabljena elucijska topila razvrstimo glede na njihovo polarnost: voda < metanol < acetonitril < etanol < tetrahidrofuran < izopropanol.Za zagotovitev dobrega zadrževanja na koloni za te vzorce (močno polarne ali visoko hidrofilne) je treba kot mobilno fazo uporabiti velik delež vodnega sistema.Vendar pa se pri uporabi sistema s čisto vodo (vključno s čisto vodo ali čisto raztopino soli) kot mobilno fazo dolga veriga ogljika na stacionarni fazi kolone C18 izogiba vodi in meša med seboj, kar ima za posledico takojšnje zmanjšanje zadrževalne zmogljivosti kolone ali celo brez zadrževanja.Ta pojav imenujemo "kolaps hidrofobne faze" (kot je prikazano na levi strani slike 1).Čeprav je to stanje reverzibilno, ko kolono speremo z organskimi topili, kot sta metanol ali acetonitril, lahko še vedno povzroči poškodbe kolone.Zato je treba preprečiti, da bi do te situacije prišlo.
Slika 1. Shematski diagram vezanih faz na površini silikagela v navadni koloni C18 (levo) in koloni C18AQ (desno).
Za reševanje zgoraj omenjenih težav so proizvajalci kromatografskih pakirnih materialov naredili tehnične izboljšave.Ena od teh izboljšav je uvedba nekaterih modifikacij na površini silicijevega matriksa, kot je uvedba hidrofilnih ciano skupin (kot je prikazano v desnem delu slike 1), da postane površina silikagela bolj hidrofilna.Tako bi se verige C18 na površini silicijevega dioksida lahko popolnoma razširile v pogojih z visoko vsebnostjo vode in se lahko izognili propadu hidrofobne faze.Te modificirane kolone C18 se imenujejo vodne kolone C18, in sicer kolone C18AQ, ki so zasnovane za pogoje eluiranja z visoko vsebnostjo vode in lahko prenesejo 100 % vodni sistem.Kolone C18AQ so bile široko uporabljene pri ločevanju in čiščenju močnih polarnih spojin, vključno z organskimi kislinami, peptidi, nukleozidi in vodotopnimi vitamini.
Razsoljevanje je ena od tipičnih uporab kolon C18AQ pri hitrem čiščenju vzorcev, ki odstrani sestavine soli ali pufra v vzorčnem topilu, da se olajša nanašanje vzorca v naslednjih študijah.V tej objavi je bil kot vzorec uporabljen Brilliant Blue FCF z močno polarnostjo in prečiščen na koloni C18AQ.Vzorčno topilo smo nadomestili z organskim topilom iz puferske raztopine, kar je olajšalo nadaljnje rotacijsko uparjanje ter prihranilo topila in čas delovanja.Poleg tega je bila čistost vzorca izboljšana z odstranitvijo nekaterih nečistoč v vzorcu.
Eksperimentalni oddelek
Slika 2. Kemijska struktura vzorca.
Brilliant Blue FCF je bil uporabljen kot vzorec v tej objavi.Čistost surovega vzorca je bila 86 %, kemijska struktura vzorca pa je prikazana na sliki 2. Za pripravo raztopine vzorca smo 300 mg praškaste surove trdne snovi Brilliant Blue FCF raztopili v 1 M pufrski raztopini NaH2PO4 in dobro pretresli, da je postalo popolnoma jasna rešitev.Raztopino vzorca smo nato z injektorjem vbrizgali v bliskovno kolono.Eksperimentalna postavitev bliskovnega čiščenja je navedena v tabeli 1.
| Instrument | Stroj SepaBean™2 | |||
| Kartuše | 12 g bliskovni vložek SepaFlash C18 RP (sferični silicijev dioksid, 20 - 45 μm, 100 Å, številka naročila: SW-5222-012-SP) | 12 g bliskovni vložek SepaFlash C18AQ RP (sferični silicijev dioksid, 20–45 μm, 100 Å, številka naročila: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Valovna dolžina | 254 nm | |||
| Mobilna faza | Topilo A: voda Topilo B: metanol | |||
| Pretok | 30 ml/min | |||
| Nalaganje vzorca | 300 mg (Brilliant Blue FCF s čistostjo 86%) | |||
| Gradient | Čas (CV) | Topilo B (%) | Čas (CV) | Topilo B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultati in razprava
Za razsoljevanje in čiščenje vzorca je bila uporabljena bliskovna kartuša SepaFlash C18AQ RP.Uporabili smo stopenjski gradient, v katerem smo kot mobilno fazo na začetku elucije uporabili čisto vodo in izvajali za 10 volumnov kolone (CV).Kot je prikazano na sliki 3, je bil vzorec pri uporabi čiste vode kot mobilne faze popolnoma ostal na bliskovni kartuši.Nato smo metanol v mobilni fazi neposredno povečali na 100 % in gradient ohranili za 7,5 CV.Vzorec smo eluirali od 11,5 do 13,5 CV.V zbranih frakcijah smo raztopino vzorca zamenjali s pufersko raztopino NaH2PO4 z metanolom.V primerjavi z visoko vodno raztopino je bilo metanol veliko lažje odstraniti z rotacijskim izparevanjem v naslednjem koraku, kar olajša naslednje raziskave.
Slika 3. Flash kromatogram vzorca na kartuši C18AQ.
Za primerjavo obnašanja zadrževanja kartuše C18AQ in običajne kartuše C18 za vzorce z močno polarnostjo je bil izveden vzporedni primerjalni test.Uporabljena je bila bliskovna kartuša SepaFlash C18 RP in bliskovni kromatogram za vzorec je prikazan na sliki 4. Za običajne kartuše C18 je najvišje tolerirano razmerje vodne faze približno 90 %.Zato je bil začetni gradient nastavljen na 10 % metanola v 90 % vode.Kot je prikazano na sliki 4, se je zaradi kolapsa hidrofobne faze verig C18, ki ga povzroča visoko vodno razmerje, vzorec komaj obdržal na navadnem vložku C18 in ga je neposredno eluirala mobilna faza.Posledično postopka razsoljevanja ali čiščenja vzorca ni mogoče dokončati.
Slika 4. Flash kromatogram vzorca na običajni kartuši C18.
V primerjavi z linearnim gradientom ima uporaba stopničastega gradienta naslednje prednosti:
1. Poraba topila in čas delovanja za čiščenje vzorca se zmanjšata.
2. Ciljni produkt se eluira z ostrim vrhom, kar zmanjša prostornino zbranih frakcij in tako olajša naslednje rotacijsko izhlapevanje ter prihrani čas.
3. Zbrani produkt je v metanolu, ki ga je enostavno izhlapeti, zato se čas sušenja skrajša.
Skratka, za čiščenje vzorca, ki je močno polaren ali visoko hidrofilen, lahko bliskovne kartuše SepaFlash C18AQ RP v kombinaciji s sistemom za preparativno bliskovno kromatografijo SepaBean™ Machine ponudijo hitro in učinkovito rešitev.
O bliskovnih kartušah SepaFlash Bonded Series C18 RP
Obstaja serija bliskovnih kartuš SepaFlash C18AQ RP z različnimi specifikacijami podjetja Santai Technology (kot je prikazano v tabeli 2).
| Številka artikla | Velikost stolpca | Pretok (mL/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabela 2. SepaFlash C18AQ RP bliskovne kartuše.
Embalažni materiali: Visoko učinkovit sferični C18(AQ) vezan silicijev dioksid, 20–45 μm, 100 Å.
logijo (kot je prikazano v tabeli 2).
Čas objave: 27. avgusta 2018