Hongcheng Wang, Bo Xu
Centrum výskumu a vývoja aplikácií
Úvod
Podľa relatívnych polarít stacionárnej fázy a mobilnej fázy možno kvapalinovú chromatografiu rozdeliť na chromatografiu s normálnou fázou (NPC) a chromatografiu na reverznej fáze (RPC).Pre RPC je polarita mobilnej fázy silnejšia ako polarita stacionárnej fázy.RPC sa stal najpoužívanejším v separačných režimoch kvapalinovou chromatografiou vďaka svojej vysokej účinnosti, dobrému rozlíšeniu a jasnému retenčnému mechanizmu.Preto je RPC vhodný na separáciu a čistenie rôznych polárnych alebo nepolárnych zlúčenín, vrátane alkaloidov, sacharidov, mastných kyselín, steroidov, nukleových kyselín, aminokyselín, peptidov, proteínov atď. V RPC sa najčastejšie používa stacionárna fáza silikagélová matrica, ktorá je viazaná rôznymi funkčnými skupinami, vrátane C18, C8, C4, fenylu, kyanoskupiny, aminoskupiny atď. Medzi týmito viazanými funkčnými skupinami je najrozšírenejšia C18.Odhaduje sa, že viac ako 80 % RPC teraz používa C18 viazanú fázu.C18 chromatografická kolóna sa preto stala nevyhnutnou univerzálnou kolónou pre každé laboratórium.
Hoci C18 kolóna môže byť použitá vo veľmi širokom rozsahu aplikácií, pre niektoré vzorky, ktoré sú veľmi polárne alebo vysoko hydrofilné, môžu mať bežné C18 kolóny problémy, keď sa používajú na čistenie takýchto vzoriek.V RPC možno bežne používané elučné rozpúšťadlá zoradiť podľa ich polarity: voda < metanol < acetonitril < etanol < tetrahydrofurán < izopropanol.Aby sa zabezpečila dobrá retencia na kolóne pre tieto vzorky (silne polárne alebo vysoko hydrofilné), je potrebné použiť ako mobilnú fázu vysoký podiel vodného systému.Avšak pri použití systému čistej vody (vrátane čistej vody alebo čistého soľného roztoku) ako mobilnej fázy má dlhý uhlíkový reťazec na stacionárnej fáze kolóny C18 tendenciu vyhýbať sa vode a navzájom sa miešať, čo má za následok okamžité zníženie retenčná kapacita kolóny alebo dokonca žiadna retencia.Tento jav sa nazýva „kolaps hydrofóbnej fázy“ (ako je znázornené v ľavej časti obrázku 1).Hoci je táto situácia reverzibilná, keď sa kolóna premyje organickými rozpúšťadlami, ako je metanol alebo acetonitril, stále môže spôsobiť poškodenie kolóny.Preto je potrebné zabrániť tejto situácii.
Obrázok 1. Schematický diagram viazaných fáz na povrchu silikagélu v bežnej kolóne C18 (vľavo) a kolóne C18AQ (vpravo).
Na vyriešenie vyššie uvedených problémov výrobcovia chromatografických baliacich materiálov urobili technické vylepšenia.Jedným z týchto zlepšení je vykonanie niektorých úprav na povrchu matrice oxidu kremičitého, ako je napríklad zavedenie hydrofilných kyanoskupín (ako je znázornené v pravej časti obrázku 1), aby sa povrch silikagélu stal hydrofilnejším.Reťazce C18 na povrchu oxidu kremičitého by teda mohli byť úplne predĺžené vo vysoko vodných podmienkach a mohlo by sa zabrániť kolapsu hydrofóbnej fázy.Tieto modifikované C18 kolóny sa nazývajú vodné C18 kolóny, menovite C18AQ kolóny, ktoré sú navrhnuté pre vysoko vodné elučné podmienky a môžu tolerovať 100% vodný systém.Kolóny C18AQ sa široko používajú pri separácii a čistení silných polárnych zlúčenín, vrátane organických kyselín, peptidov, nukleozidov a vitamínov rozpustných vo vode.
Odsoľovanie je jednou z typických aplikácií kolón C18AQ pri rýchlom čistení vzoriek, ktoré odstraňuje soľ alebo zložky pufra v rozpúšťadle vzorky, aby sa uľahčilo nanášanie vzorky v nasledujúcich štúdiách.V tomto príspevku sa ako vzorka použila Brilliant Blue FCF so silnou polaritou a purifikovala sa na kolóne C18AQ.Rozpúšťadlo vzorky bolo nahradené organickým rozpúšťadlom z tlmivého roztoku, čím sa uľahčilo nasledujúce rotačné odparovanie, ako aj úspora rozpúšťadiel a prevádzkového času.Okrem toho sa čistota vzorky zlepšila odstránením niektorých nečistôt vo vzorke.
experimentálna sekcia
Obrázok 2. Chemická štruktúra vzorky.
Brilantná modrá FCF bola použitá ako vzorka v tomto príspevku.Čistota surovej vzorky bola 86 % a chemická štruktúra vzorky je znázornená na obrázku 2. Na prípravu roztoku vzorky sa 300 mg práškovej surovej tuhej látky Brilliant Blue FCF rozpustilo v 1 M tlmivom roztoku NaH2PO4 a dobre sa pretrepalo, aby úplne jasné riešenie.Roztok vzorky sa potom vstrekol do flash kolóny injektorom.Experimentálne nastavenie bleskového čistenia je uvedené v tabuľke 1.
| nástroj | Stroj SepaBean™2 | |||
| Kazety | 12 g blesková kazeta SepaFlash C18 RP (guľovitý oxid kremičitý, 20 - 45 μm, 100 Å, objednávacie číslo: SW-5222-012-SP) | 12 g blesková kazeta SepaFlash C18AQ RP (guľovitý oxid kremičitý, 20 - 45 μm, 100 Å, objednávacie číslo：SW-5222-012-SP(AQ))) | ||
| Vlnová dĺžka | 254 nm | |||
| Mobilná fáza | Rozpúšťadlo A: Voda Rozpúšťadlo B: Metanol | |||
| Prietok | 30 ml/min | |||
| Načítanie vzorky | 300 mg (Brilantná modrá FCF s čistotou 86 %) | |||
| Gradient | čas (CV) | Rozpúšťadlo B (%) | čas (CV) | Rozpúšťadlo B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Výsledky a diskusia
Na odsoľovanie a čistenie vzoriek sa použila blesková kazeta SepaFlash C18AQ RP.Použil sa stupňovitý gradient, v ktorom sa ako mobilná fáza na začiatku elúcie použila čistá voda a robila sa 10 objemov kolóny (CV).Ako je znázornené na obrázku 3, pri použití čistej vody ako mobilnej fázy bola vzorka úplne zadržaná na flash kazete.Ďalej sa metanol v mobilnej fáze priamo zvýšil na 100 % a gradient sa udržiaval počas 7,5 CV.Vzorka sa eluovala od 11,5 do 13,5 CV.V zozbieraných frakciách bol roztok vzorky nahradený roztokom pufra NaH2P04 za metanol.V porovnaní s vysoko vodným roztokom sa metanol oveľa ľahšie odstránil rotačným odparovaním v nasledujúcom kroku, čo uľahčuje nasledujúci výskum.
Obrázok 3. Bleskový chromatogram vzorky na kazete C18AQ.
Na porovnanie retenčného správania kazety C18AQ a bežnej kazety C18 pre vzorky so silnou polaritou sa uskutočnil paralelný porovnávací test.Použila sa blesková kazeta SepaFlash C18 RP a bleskový chromatogram vzorky je znázornený na obrázku 4. Pre bežné kazety C18 je najvyšší tolerovaný pomer vodnej fázy približne 90 %.Preto bol počiatočný gradient nastavený na 10 % metanolu v 90 % vode.Ako je znázornené na obrázku 4, v dôsledku kolapsu hydrofóbnej fázy reťazcov C18 spôsobeného vysokým vodným pomerom sa vzorka sotva zachytila na bežnej kazete C18 a bola priamo eluovaná mobilnou fázou.V dôsledku toho nie je možné dokončiť operáciu odsoľovania alebo čistenia vzorky.
Obrázok 4. Bleskový chromatogram vzorky na bežnej kazete C18.
V porovnaní s lineárnym gradientom má použitie stupňovitého gradientu tieto výhody:
1. Skrátila sa spotreba rozpúšťadla a doba spracovania vzorky.
2. Cieľový produkt sa eluuje v ostrom píku, čo znižuje objem zozbieraných frakcií a tým uľahčuje následné rotačné odparovanie a zároveň šetrí čas.
3. Zozbieraný produkt je v metanole, ktorý sa ľahko odparuje, čím sa skráti čas sušenia.
Záverom možno povedať, že na čistenie vzorky, ktorá je silne polárna alebo vysoko hydrofilná, môžu bleskové kazety SepaFlash C18AQ RP v kombinácii so systémom preparatívnej bleskovej chromatografie SepaBean™ Machine ponúknuť rýchle a efektívne riešenie.
O bleskových kazetách SepaFlash Bonded Series C18 RP
Existuje séria bleskových kaziet SepaFlash C18AQ RP s rôznymi špecifikáciami od Santai Technology (ako je uvedené v tabuľke 2).
| Číslo položky | Veľkosť stĺpca | Prietok (ml/min) | Maximálny tlak (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabuľka 2. Bleskové kazety SepaFlash C18AQ RP.
Obalové materiály: Vysokoúčinný sférický oxid kremičitý C18(AQ), 20 - 45 μm, 100 Å.
(ako je uvedené v tabuľke 2).
Čas odoslania: 27. augusta 2018