Hongcheng Wang, Bo Xu
Centrum výskumu a vývoja aplikácií
Zavedenie
Podľa relatívnej polarity stacionárnej fázy a mobilnej fázy je možné kvapalinovú chromatografiu rozdeliť na normálnu fázovú chromatografiu (NPC) a obrátenú fázovú chromatografiu (RPC). Pre RPC je polarita mobilnej fázy silnejšia ako polarita stacionárnej fázy. RPC sa stala najčastejšie používanou v režimoch separácie kvapaliny chromatografie kvôli svojmu vysokému účinnosti, dobrým rozlíšením a čistým retenčným mechanizmom. Preto je RPC vhodný na separáciu a čistenie rôznych polárnych alebo nepolárnych zlúčenín, vrátane alkaloidov, uhľohydrátov, mastných kyselín, steroidov, nukleových kyselín, aminokyselín, peptidov, proteínov atď. V RPC, najbežnejšie používanej stacionárnej fáze sú kremíkovo gélové matrix, ktoré sú spojené s rôznymi funkčnými skupinami, vrátane C18, C4, C4 a Cyano, Cyano, Cyano, Cyano, Cyano, Cyano, Cyano, Cyano, Cyano, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, Cyo, kremíkovej géli Amino atď. Medzi týmito väzbovými funkčnými skupinami je najpoužívanejšou skupinou C18. Odhaduje sa, že viac ako 80% RPC teraz používa fázu viazanú na C18. Preto sa chromatografia C18 stala nevyhnutným univerzálnym stĺpom pre každé laboratórium.
Aj keď stĺpec C18 sa môže použiť vo veľmi širokej škále aplikácií, pre niektoré vzorky, ktoré sú veľmi polárne alebo vysoko hydrofilné, môžu mať pravidelné stĺpce C18 problémy, keď sa používajú na čistenie takýchto vzoriek. V RPC sa bežne používané elučné rozpúšťadlá môžu objednať podľa ich polarity: voda <metanol <acetonitril <etanol <tetrahydrofuran <izopropanol. Na zabezpečenie dobrého zadržiavania na kolóne pre tieto vzorky (silné polárne alebo vysoko hydrofilné) je potrebné použiť vysoký podiel vodného systému, aby sa použil ako mobilná fáza. Avšak pri použití čistej vody (vrátane čistej vody alebo roztoku čistého soli) ako mobilnej fázy je dlhý uhlíkový reťazec v stacionárnej fáze kolóny C18 tendenciu vyhnúť sa vode a navzájom sa miešať, čo vedie k okamžitému zníženiu retenčnej kapacity stĺpca alebo dokonca k retencii. Tento jav sa nazýva „kolaps hydrofóbnej fázy“ (ako je znázornené v ľavej časti obrázku 1). Aj keď je táto situácia reverzibilná, keď sa stĺpec premyje organickými rozpúšťadlami, ako je metanol alebo acetonitril, stále môže spôsobiť poškodenie stĺpca. Preto je potrebné zabrániť tejto situácii.
Obrázok 1. Schematický diagram viazaných fáz na povrchu silikagélu v pravidelnom kolóne C18 (vľavo) a C18aq stĺp (vpravo).
Na riešenie vyššie uvedených problémov výrobcovia chromatografických materiálov na obaly urobili technické vylepšenia. Jedným z týchto vylepšení je vykonanie niektorých modifikácií na povrchu matrice oxidu kremičitého, ako je zavedenie hydrofilných kyano skupín (ako je znázornené na pravej časti obrázku 1), aby bol povrch silikagélu hydrofilnejší. Reťazce C18 na povrchu oxidu kremičitého by sa teda mohli úplne predĺžiť za vysoko vodných podmienok a bolo možné vyhnúť sa kolapsu hydrofóbnej fázy. Tieto modifikované stĺpce C18 sa nazývajú vodné stĺpce C18, konkrétne stĺpce C18AQ, ktoré sú určené pre vysoko vodné elučné podmienky a môžu tolerovať 100% vodný systém. Stĺpce C18AQ sa široko aplikovali pri separácii a čistení silných polárnych zlúčenín vrátane organických kyselín, peptidov, nukleozidov a vitamínov rozpustných vo vode.
Odpojenie je jednou z typických aplikácií stĺpcov C18AQ v bleskovom purifikácii pre vzorky, ktoré odstraňuje komponenty soli alebo pufra vo vzorkovom rozpúšťadle, aby sa uľahčilo použitie vzorky v nasledujúcich štúdiách. V tomto príspevku sa ako vzorka použila brilantná modrá FCF so silnou polaritou a vyčistila sa na stĺpci C18AQ. Rozpúšťadlo vzorky bolo nahradené organickým rozpúšťadlom z roztoku pufra, čím sa uľahčilo nasledujúce odstránenie rotárov, ako aj šetrenie rozpúšťadiel a prevádzkový čas. Ďalej sa čistota vzorky zlepšila odstránením niektorých nečistôt vo vzorke.
Experimentálna časť
Obrázok 2. Chemická štruktúra vzorky.
Brilantná modrá FCF sa použila ako vzorka v tomto príspevku. Čistota surovej vzorky bola 86% a chemická štruktúra vzorky bola znázornená na obrázku 2. Na prípravu roztoku vzorky sa 300 mg prášková surová tuhá látka brilantnej modrej FCF rozpustila v 1 m NAH2PO4 roztoku tlmivého roztoku a dobre sa otriasla úplne jasným roztokom. Roztok vzorky bol potom vstreknutý do kolóny Flash injektorom. Experimentálne nastavenie čistenia blesku je uvedené v tabuľke 1.
| Prístroj | Stroj Sepabean ™2 | |||
| Kazety | 12 G Sepaflash C18 RP Flash Cable (sférický oxid kremičitý, 20-45 μm, 100 Á, číslo objednávky: SW-5222-012-SP) | 12 G Sepaflash C18AQ RP Flash Cableredle (sférický oxid kremičitý, 20-45 μm, 100 Á, číslo objednávky ： SW-5222-012-SP (aq)） | ||
| Vlnová dĺžka | 254 nm | |||
| Mobilná fáza | Rozpúšťadlo A ： Voda Rozpúšťadlo B ： metanol | |||
| Prietok | 30 ml/min | |||
| Zaťaženie vzorky | 300 mg (brilantná modrá FCF s čistotou 86%) | |||
| Gradient | Čas (cv) | Rozpúšťadlo B (%) | Čas (cv) | Rozpúšťadlo B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Výsledky
Na odsoľovanie a čistenie vzorky sa použila kazeta Flash SEPAFLASH C18AQ RP Flash. Využil sa krokový gradient, v ktorom sa ako mobilná fáza použila čistá voda na začiatku elucie a bežala pre 10 objemov stĺpcov (CV). Ako je znázornené na obrázku 3, pri použití čistej vody ako mobilnej fázy sa vzorka úplne zachovala na kazete Flash. Ďalej sa metanol v mobilnej fáze priamo zvýšil na 100% a gradient sa udržiaval na 7,5 cv. Vzorka bola eluovaná z 11,5 na 13,5 cv. V zhromaždených frakciách sa roztok vzorky nahradil z roztoku pufra NAH2PO4 na metanol. V porovnaní s vysoko vodným roztokom bolo metanol v nasledujúcom kroku omnoho ľahšie odstránené odparením rotačným odparením, čo uľahčuje nasledujúci výskum.
Obrázok 3. Flash chromatogram vzorky na kazete C18AQ.
Na porovnanie retenčného správania kazety C18AQ a bežnej kazety C18 pre vzorky silnej polarity sa uskutočnil test paralelného porovnávania. Použila sa kazeta SEPAFLASH C18 RP Flash a bleskový chromatogram pre vzorku bol znázornený na obrázku 4. Pre bežné kazety C18 je najvyšší tolerovaný pomer vodnej fázy asi 90%. Preto bol štartovací gradient stanovený na 10% metanolu v 90% vody. Ako je znázornené na obrázku 4, v dôsledku kolapsu hydrofóbnej fázy reťazcov C18 spôsobených vysokým vodným pomerom sa vzorka sotva zachovala na bežnej kazete C18 a bola priamo eluovaná mobilnou fázou. V dôsledku toho nie je možné dokončiť činnosť odsoľovania alebo čistenia vzorky.
Obrázok 4. Flash chromatogram vzorky na bežnej kazete C18.
V porovnaní s lineárnym gradientom má použitie krokového gradientu tieto výhody:
1. Použitie rozpúšťadla a čas spustenia na čistenie vzorky sa skráti.
2. Cieľový produkt sa elatuje v ostrom píku, ktorý znižuje objem zozbieraných frakcií, a tak uľahčuje nasledujúce odparenie rotárov, ako aj čas šetrenia.
3. Zhromaždený produkt je v metanole, ktorý sa ľahko odparí, a preto sa skráti čas sušenia.
Záverom možno povedať, že na čistenie vzorky, ktorá je silne polárna alebo vysoko hydrofilná, môže Sepaflash C18AQ RP bleskové kazety kombinujúce s prístrojom SEPABEAN ™ s prípravným flash chromatografickým systémom ponúknuť rýchle a efektívne riešenie.
O Sepaflash Bonded Series C18 RP Flash Cartridges
Existuje séria kazety SEPAFLASH C18AQ RP Flash s rôznymi špecifikáciami z technológie Santai (ako je uvedené v tabuľke 2).
| Číslo položky | Veľkosť stĺpca | Prietok (ml/min) | Max. (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP (aq) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabuľka 2. Sepaflash C18AQ RP Flash Cartridges.
Balenie materiálov: vysokoúčinný sférický oxid kremičitý C18 (AQ), 20-45 μm, 100 Á.
LOGY (ako je uvedené v tabuľke 2).
Čas príspevku: august-27-2018