Хунчэн Ван, Бо Сюй
Центр прикладных исследований и разработок
Введение
В соответствии с относительной полярностью неподвижной и подвижной фаз жидкостную хроматографию можно разделить на нормально-фазовую хроматографию (NPC) и обращенно-фазовую хроматографию (RPC).Для RPC полярность подвижной фазы сильнее, чем у неподвижной фазы.RPC стал наиболее широко используемым в режимах разделения жидкостной хроматографии из-за его высокой эффективности, хорошего разрешения и четкого механизма удерживания.Поэтому RPC подходит для разделения и очистки различных полярных или неполярных соединений, включая алкалоиды, углеводы, жирные кислоты, стероиды, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, пептиды, белки и т. д. В RPC наиболее часто используемой стационарной фазой является матрица силикагеля, которая связана с различными функциональными группами, включая C18, C8, C4, фенил, циано, амино и т. д. Среди этих связанных функциональных групп наиболее широко используемой является C18.Подсчитано, что более 80% RPC в настоящее время используют связанную фазу C18.Поэтому хроматографическая колонка С18 стала обязательной универсальной колонкой для каждой лаборатории.
Хотя колонка C18 может использоваться в очень широком диапазоне применений, однако для некоторых образцов, которые являются очень полярными или сильно гидрофильными, при использовании обычных колонок C18 для очистки таких образцов могут возникать проблемы.В RPC обычно используемые элюирующие растворители можно расположить в порядке их полярности: вода < метанол < ацетонитрил < этанол < тетрагидрофуран < изопропанол.Чтобы обеспечить хорошее удерживание на колонке для этих образцов (сильнополярных или высокогидрофильных), необходимо использовать в качестве подвижной фазы большое количество водной системы.Однако при использовании системы чистой воды (включая чистую воду или раствор чистой соли) в качестве подвижной фазы длинная углеродная цепь на неподвижной фазе колонки C18 имеет тенденцию избегать воды и смешиваться друг с другом, что приводит к мгновенному снижению удерживающая способность колонки или даже ее полное отсутствие.Это явление называется «коллапсом гидрофобной фазы» (как показано в левой части рисунка 1).Хотя эта ситуация обратима, когда колонку промывают органическими растворителями, такими как метанол или ацетонитрил, это все равно может привести к повреждению колонки.Поэтому необходимо предотвратить возникновение данной ситуации.
Рис. 1. Схематическая диаграмма связанных фаз на поверхности силикагеля в обычной колонке C18 (слева) и колонке C18AQ (справа).
Для решения вышеупомянутых проблем производители хроматографических упаковочных материалов внесли технические усовершенствования.Одним из таких улучшений является внесение некоторых модификаций на поверхность кремнеземной матрицы, например введение гидрофильных цианогрупп (как показано в правой части рисунка 1), чтобы сделать поверхность силикагеля более гидрофильной.Таким образом, цепи C18 на поверхности кремнезема могут быть полностью вытянуты в сильноводных условиях, и можно избежать коллапса гидрофобной фазы.Эти модифицированные колонки C18 называются водными колонками C18, а именно колонками C18AQ, которые предназначены для условий элюирования с высоким содержанием воды и могут выдерживать 100% водную систему.Колонки C18AQ широко применяются для разделения и очистки сильных полярных соединений, включая органические кислоты, пептиды, нуклеозиды и водорастворимые витамины.
Обессоливание является одним из типичных применений колонок C18AQ при мгновенной очистке образцов, которая удаляет компоненты соли или буфера из растворителя образца, чтобы облегчить применение образца в последующих исследованиях.В этом посте в качестве образца использовался бриллиантовый синий FCF с сильной полярностью, очищенный на колонке C18AQ.Растворитель образца был заменен органическим растворителем из буферного раствора, что облегчило последующее роторное испарение, а также позволило сэкономить растворители и время работы.Кроме того, чистота образца была улучшена за счет удаления некоторых примесей из образца.
Экспериментальная секция
Рисунок 2. Химическая структура образца.
Brilliant Blue FCF использовался в качестве образца в этом посте.Чистота исходного образца составляла 86%, а химическая структура образца показана на рис. 2. Для приготовления раствора образца 300 мг порошкообразного неочищенного твердого вещества бриллиантового синего FCF растворяли в 1 М буферном растворе NaH2PO4 и хорошо встряхивали, чтобы он стал однородным. совершенно прозрачное решение.Затем раствор пробы вводили во флэш-колонку с помощью инжектора.Экспериментальная установка мгновенной очистки приведена в таблице 1.
| Инструмент | Машина SepaBean™2 | |||
| Картриджи | Флэш-картридж SepaFlash C18 RP, 12 г (сферический силикагель, 20–45 мкм, 100 Å, номер для заказа: SW-5222-012-SP) | Картридж SepaFlash C18AQ RP, 12 г (сферический силикагель, 20–45 мкм, 100 Å, номер для заказа: SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Длина волны | 254 нм | |||
| Мобильная фаза | Растворитель А：вода Растворитель B: метанол | |||
| Скорость потока | 30 мл/мин | |||
| Загрузка образца | 300 мг (Brilliant Blue FCF чистотой 86%) | |||
| Градиент | Время (резюме) | Растворитель Б (%) | Время (резюме) | Растворитель Б (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17,5 | 100 | 17,5 | 100 | |
| 17,6 | 10 | 17,6 | 0 | |
| 22,6 | 10 | 22,6 | 0 | |
Результаты и обсуждение
Для обессоливания и очистки проб использовали флэш-картридж SepaFlash C18AQ RP.Использовался ступенчатый градиент, в котором чистая вода использовалась в качестве подвижной фазы в начале элюирования и выполнялась для 10 объемов колонки (CV).Как показано на рис. 3, при использовании чистой воды в качестве подвижной фазы образец полностью удерживался на флеш-картридже.Затем содержание метанола в подвижной фазе сразу увеличивали до 100% и поддерживали градиент в течение 7,5 CV.Образец элюировался от 11,5 до 13,5 CV.В собранных фракциях раствор пробы заменяли с буферного раствора NaH2PO4 на метанол.По сравнению с высоководным раствором, метанол гораздо легче удалялся роторным испарителем на последующей стадии, что облегчало последующие исследования.
Рисунок 3. Флэш-хроматограмма образца на картридже C18AQ.
Чтобы сравнить поведение картриджа C18AQ и обычного картриджа C18 для образцов с сильной полярностью, был проведен параллельный сравнительный тест.Использовался флэш-картридж SepaFlash C18 RP, и флэш-хроматограмма для образца показана на рис. 4. Для обычных картриджей C18 максимально допустимое соотношение водной фазы составляет около 90%.Поэтому начальный градиент был установлен на уровне 10% метанола в 90% воды.Как показано на рис. 4, из-за коллапса гидрофобной фазы цепей C18, вызванного высоким содержанием воды, образец почти не удерживался на обычном картридже C18 и непосредственно элюировался подвижной фазой.В результате операция обессоливания или очистки пробы не может быть завершена.
Рисунок 4. Флэш-хроматограмма образца на обычном картридже С18.
По сравнению с линейным градиентом использование ступенчатого градиента имеет следующие преимущества:
1. Сокращение использования растворителя и времени очистки проб.
2. Целевой продукт элюируется в виде острого пика, что уменьшает объем собираемых фракций и, таким образом, облегчает последующее роторное испарение, а также экономит время.
3. Собранный продукт находится в метаноле, который легко испаряется, что сокращает время сушки.
В заключение, для очистки образца, который является сильно полярным или сильно гидрофильным, флэш-картриджи SepaFlash C18AQ RP в сочетании с системой препаративной флэш-хроматографии SepaBean™ Machine могут предложить быстрое и эффективное решение.
О флэш-картриджах SepaFlash Bonded Series C18 RP
Компания Santai Technology предлагает серию флэш-картриджей SepaFlash C18AQ RP с различными характеристиками (как показано в таблице 2).
| Номер предмета | Размер столбца | Скорость потока (мл/мин) | Максимальное давление (пси/бар) |
| SW-5222-004-СП(АК) | 5,4 г | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-СП(АК) | 20 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-СП(АК) | 33 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-СП(АК) | 48 г | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-СП(АК) | 105 г | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-СП(АК) | 155 г | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-СП(АК) | 300 г | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-СП(АК) | 420 г | 40-80 | 250/17,2 |
Таблица 2. Флэш-картриджи SepaFlash C18AQ RP.
Уплотнительные материалы: высокоэффективный сферический диоксид кремния, связанный C18(AQ), 20–45 мкм, 100 Å.
логика (как показано в таблице 2).
Время публикации: 27 августа 2018 г.