Hongcheng Wang, Bo Xu
Приложение Центр исследований и разработок
Введение
Согласно относительной полярности стационарной фазы и подвижной фазы, жидкая хроматография может быть разделена на нормальную фазовую хроматографию (NPC) и обратную фазовую хроматографию (RPC). Для RPC полярность подвижной фазы сильнее, чем стационарная фаза. RPC стал наиболее широко используемым в режимах разделения жидкой хроматографии из -за его высокой эффективности, хорошего разрешения и механизма четкого удержания. Следовательно, RPC подходит для разделения и очистки различных полярных или неполярных соединений, включая алкалоиды, углеводы, жирные кислоты, стероиды, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, пептиды, белки и т. Д. В RPC, наиболее часто используемой стационарной фазе-C18, C-8, C18, C-8, C, C, C-фенил, C-8, C-8, C, C, C, C, C-фенил, C, C, C-фенил, C-8, C-8, C, C, C, C-фенил. Cyano, амино и т. Д. Среди этих связанных функциональных групп наиболее широко используемым является C18. По оценкам, более 80% RPC в настоящее время используют связанную фазу C18. Поэтому колонна хроматографии C18 стала обязательной универсальной колонкой для каждой лаборатории.
Хотя колонка C18 может использоваться в очень широком диапазоне применений, однако, для некоторых образцов, которые являются очень полярными или очень гидрофильными, регулярные колонны C18 могут иметь проблемы при использовании для очистки таких образцов. В RPC широко используемые растворители элюирования могут быть упорядочены в соответствии с их полярностью: вода <метанол <ацетонитрил <этанол <тетрагидрофуран <изопропанол. Чтобы обеспечить хорошее удержание на колонке для этих образцов (сильных полярных или высокопрофильных), необходимо использовать высокую долю водной системы в качестве подвижной фазы. Однако при использовании системы чистой воды (включая чистую воду или чисто солевую раствор) в качестве подвижной фазы, длинная углеродная цепь на стационарной фазе столбца C18 имеет тенденцию избегать воды и смешиваться друг с другом, что приводит к мгновенному снижению удерживающей способности колонны или даже отсутствия удержания. Это явление называется «гидрофобным фазовым коллапсом» (как показано в левой части рисунка 1). Хотя эта ситуация обратима, когда колонна промывается органическими растворителями, такими как метанол или ацетонитрил, она все равно может нанести повреждение колонны. Следовательно, необходимо предотвратить эту ситуацию.
Рисунок 1. Схематическая диаграмма связанных фаз на поверхности силикагеля в обычной колонке C18 (слева) и C18AQ Column (справа).
Чтобы решить вышеупомянутые проблемы, производители хроматографических упаковочных материалов сделали технические улучшения. Одним из этих улучшений является некоторые модификации на поверхности матрицы кремнезема, таких как введение гидрофильных групп циано (как показано в правой части рисунка 1), чтобы сделать поверхность силикагеля более гидрофильной. Таким образом, цепи C18 на поверхности кремнезема могут быть полностью расширены в условиях высоко водного, и можно избежать гидрофобного фазового коллапса. Эти модифицированные колонны C18 называются водными колоннами C18, а именно колонны C18AQ, которые предназначены для условий элюирования с высокой водностью и могут переносить 100% водную систему. Колонны C18AQ широко применяются при разделении и очистке сильных полярных соединений, включая органические кислоты, пептиды, нуклеозиды и водорастворимые витамины.
Оспания является одним из типичных применений колонн C18AQ в очистке вспышки для образцов, которые удаляют солевые или буферные компоненты в растворителе образца, чтобы облегчить применение образца в последующих исследованиях. В этом посте блестящий синий FCF с сильной полярностью использовался в качестве образца и очищен в колонке C18AQ. Растворитель образца был заменен органическим растворителем из буферного раствора, что облегчало следующее вращательное испарение, а также сохранение растворителей и времени работы. Кроме того, чистота образца была улучшена путем удаления некоторых примесей в образце.
Экспериментальный раздел
Рисунок 2. Химическая структура образца.
Блестящий синий FCF использовался в качестве образца в этом посте. Чистота необработанного образца составляла 86%, а химическая структура образца была показана на рисунке 2. Для приготовления раствора для образца, 300 мг порошкообразной сырой твердого вещества из блестящего синего FCF растворяли в 1 м. Раствор буфера NAH2PO4 и хорошо дрожат, чтобы стать совершенно чистым раствором. Раствор образца затем вводили в колонку флэш -колонны инжектором. Экспериментальная настройка очистки вспышки указана в таблице 1.
| Инструмент | Машина Sepabean ™2 | |||
| Картриджи | 12 г Sepaflash C18 RP Flash Cartridge (сферический кремнезем, 20-45 мкм, 100 Å, номер заказа: SW-5222-012-SP) | 12 г Sepaflash C18AQ RP Flash Cartridge (сферический кремнезем, 20-45 мкм, 100 Å, номер заказа ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Длина волны | 254 нм | |||
| Мобильная фаза | Растворитель A ： Вода Растворитель B ： метанол | |||
| Скорость потока | 30 мл/мин | |||
| Образец загрузка | 300 мг (блестящий синий FCF с чистотой 86%) | |||
| Градиент | Время (CV) | Растворитель B (%) | Время (CV) | Растворитель B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Результаты и обсуждение
Флэш -картридж Sepaflash C18AQ RP был использован для ослабления и очистки образца. Был использован шаг градиент, в котором чистая вода использовалась в качестве подвижной фазы в начале элюирования и запускается для 10 томов колонны (CV). Как показано на рисунке 3, при использовании чистой воды в качестве подвижной фазы образец был полностью сохранен на флэш -картридже. Затем метанол в подвижной фазе был непосредственно увеличен до 100%, а градиент поддерживался в течение 7,5 CV. Образец элюировали с 11,5 до 13,5 CV. В собранных фракциях раствор образца был заменен от буферного раствора NAH2PO4 до метанола. Сравнивая с очень водным раствором, метанол было намного легче удалить с помощью роторного испарения на последующем этапе, что облегчает следующее исследование.
Рисунок 3. Флэш -хроматограмма образца на картридже C18AQ.
Чтобы сравнить поведение удержания картриджа C18AQ и обычного картриджа C18 для образцов сильной полярности, был проведен параллельный сравнительный тест. Использовался флэш -картридж Sepaflash C18 RP, и флэш -хроматограмма для образца была показана на рисунке 4. Для обычных картриджей C18 самое высокое переносимое отношение водной фазы составляет около 90%. Поэтому начальный градиент был установлен на 10% метанола в 90% воды. Как показано на рисунке 4, из -за гидрофобной фазы коллапса цепей C18, вызванного высоким водным соотношением, образец едва сохранялся на обычном картридже C18 и был непосредственно элюирован подвижной фазой. В результате, операция облегчения или очищения образца не может быть завершена.
Рисунок 4. Флэш -хроматограмма образца на обычном картридже C18.
Сравнивая с линейным градиентом, использование шагового градиента имеет следующие преимущества:
1. Использование растворителя и время выполнения для очистки образца уменьшаются.
2. Целевой продукт элюирует в резком пике, который уменьшает объем собранных фракций и, таким образом, облегчает следующее вращательное испарение, а также время экономии.
3. Собранное продукт находится в метаноле, который легко испарить, поэтому время сушки уменьшается.
В заключение, для очистки образца, которая является сильно полярной или очень гидрофильной, вспышки Sepaflash C18AQ RP, в сочетании с препаративной системой флэш -хроматографии Sepabean ™, могут предложить быстрое и эффективное решение.
О вмешательстве Sepaflash Series C18 RP Flash Cartridges
Существует ряд картриджей Sepaflash C18AQ RP с различными спецификациями технологии Santai (как показано в таблице 2).
| Номер предмета | Размер столбца | Скорость потока (мл/мин) | Макс (PSI/BAR) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 г | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 г. | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 г. | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 г. | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 г. | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 г. | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 г. | 40-80 | 250/17.2 |
Таблица 2. Sepaflash C18AQ RP Flash Cartridges.
Упаковочные материалы: высокоэффективная сферическая C18 (AQ)-связанный кремнезем, 20-45 мкм, 100 Å.
Лога (как показано в таблице 2).
Время сообщения: 27-2018 августа