Rui Huang, Bo Xu
Centrul de cercetare și dezvoltare de aplicații
Introducere
O peptidă este un compus compus din aminoacizi, fiecare dintre care are proprietăți fizice și chimice unice datorită diferitelor tipuri și ordine de reziduuri de aminoacizi care constituie secvența sa.Odată cu dezvoltarea sintezei chimice în fază solidă, sinteza chimică a diferitelor peptide active a făcut progrese mari.Cu toate acestea, datorită compoziției complicate a peptidei obținute prin sinteza în fază solidă, produsul final trebuie purificat prin metode de separare fiabile.Metodele de purificare utilizate în mod obișnuit pentru peptide includ cromatografia cu schimb de ioni (IEC) și cromatografia lichidă de înaltă performanță în fază inversă (RP-HPLC), care au dezavantajele capacității scăzute de încărcare a probei, costul ridicat al mediilor de separare, echipamentul de separare complicat și costisitor, etc. Pentru purificarea rapidă a peptidelor cu molecule mici (MW < 1 kDa), Santai Technologies a publicat un caz de aplicare de succes, în care un cartuş SepaFlash RP C18 a fost utilizat pentru purificarea rapidă a timopentinei (TP-5) şi a a fost obținut produsul țintă care îndeplinește cerințele.
Figura 1. 20 de aminoacizi comuni (reproduși de pe www.bachem.com).
Există 20 de tipuri de aminoacizi care sunt obișnuiți în compoziția peptidelor.Acești aminoacizi pot fi împărțiți în următoarele grupe în funcție de polaritate și proprietăți acido-bazice: nepolar (hidrofob), polar (neîncărcat), acid sau bazic (așa cum se arată în Figura 1).Într-o secvență de peptide, dacă aminoacizii care constituie secvența sunt în mare parte polari (așa cum sunt marcați cu culoarea roz în Figura 1), cum ar fi cisteina, glutamină, asparagină, serină, treonină, tirozină etc., atunci această peptidă ar putea avea o puternică polaritate și să fie foarte solubil în apă.În timpul procedurii de purificare pentru aceste eșantioane de peptide polare puternice prin cromatografie în fază inversă, va avea loc un fenomen numit colaps de fază hidrofobă (consultați o notă de aplicare publicată anterior de către Santai Technologies: Hydrophobic Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).În comparație cu coloanele C18 obișnuite, coloanele C18AQ îmbunătățite sunt cele mai potrivite pentru purificarea probelor polare sau hidrofile puternice.În această postare, o peptidă polară puternică a fost utilizată ca probă și purificată printr-o coloană C18AQ.Ca urmare, produsul țintă care îndeplinește cerințele a fost obținut și a putut fi utilizat în următoarele cercetări și dezvoltare.
| Instrument | SepaBean™masina 2 | |||
| Cartușe | Cartuș flash SepaFlash C18 RP de 12 g (silice sferic, 20 - 45 μm, 100 Å, Numărul de comandă: SW-5222-012-SP) | Cartuș flash SepaFlash C18AQ RP de 12 g (silice sferic, 20 - 45 μm, 100 Å, Număr comandă：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Lungime de undă | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Faza mobila | Solvent A: apă Solvent B: acetonitril | |||
| Debitul | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Încărcarea probei | 30 mg | |||
| Gradient | Ora (CV) | Solvent B (%) | Timp (min) | Solvent B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20,0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29,0 | 87 | |||
Rezultate și discuții
Pentru a compara performanța de purificare pentru proba de peptidă polară între coloana C18 obișnuită și coloana C18AQ, am folosit o coloană C18 obișnuită pentru purificarea rapidă a probei ca început.După cum se arată în Figura 2, din cauza colapsului fazei hidrofobe a lanțurilor C18 cauzată de raportul apos ridicat, proba abia a fost reținută pe cartuşul obișnuit C18 și a fost eluată direct de faza mobilă.Ca rezultat, proba nu a fost separată și purificată în mod eficient.
Figura 2. Cromatograma flash a probei pe un cartuş C18 obişnuit.
Apoi, am folosit o coloană C18AQ pentru purificarea rapidă a probei.După cum se arată în Figura 3, peptida a fost reținută în mod eficient pe coloană și apoi a fost eluată.Produsul țintă a fost separat de impuritățile din proba brută și colectat.După liofilizare și apoi analizat prin HPLC, produsul purificat are o puritate de 98,2% și ar putea fi utilizat în continuare pentru cercetarea și dezvoltarea următoarei etape.
Figura 3. Cromatograma flash a probei pe un cartuş C18AQ.
În concluzie, cartuşul flash SepaFlash C18AQ RP combinat cu sistemul de cromatografie flash SepaBean™mașina ar putea oferi o soluție rapidă și eficientă pentru purificarea probelor polare sau hidrofile puternice.
Există o serie de cartușe flash SepaFlash C18AQ RP cu specificații diferite de la Santai Technology (după cum se arată în Tabelul 2).
| Numărul de articol | Dimensiunea coloanei | Debitul (ml/min) | Presiune max (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabelul 2. Cartușe flash SepaFlash C18AQ RP.Materiale de ambalare: silice sferică C18(AQ) de înaltă eficiență, 20 - 45 μm, 100 Å.
Pentru mai multe informații despre specificațiile detaliate ale aparatului SepaBean™ sau informații despre comandarea cartușelor flash din seria SepaFlash, vă rugăm să vizitați site-ul nostru web.
Ora postării: Oct-12-2018