Hongcheng Wang, Bo Xu
Centrul de cercetare și dezvoltare a aplicației
Introducere
Conform polarităților relative ale fazei staționare și ale fazei mobile, cromatografia lichidă poate fi împărțită în cromatografie în fază normală (NPC) și cromatografie în fază inversată (RPC). Pentru RPC, polaritatea fazei mobile este mai puternică decât cea a fazei staționare. RPC a devenit cel mai utilizat în moduri în moduri de separare a cromatografiei lichide datorită eficienței sale ridicate, rezoluției bune și mecanismului de retenție clar. Therefore RPC is suitable for the separation and purification of various polar or non-polar compounds, including alkaloids, carbohydrates, fatty acids, steroids, nucleic acids, amino acids, peptides, proteins, etc. In RPC, the most commonly used stationary phase is the silica gel matrix which is bonded with various functional groups, including C18, C8, C4, phenyl, Cyano, amino, etc. Printre aceste grupuri funcționale legate, cel mai utilizat cel mai utilizat este C18. Se estimează că mai mult de 80% din RPC folosesc acum faza legată de C18. Prin urmare, coloana de cromatografie C18 a devenit o coloană universală obligatorie pentru fiecare laborator.
Deși coloana C18 poate fi utilizată într -o gamă foarte largă de aplicații, cu toate acestea, pentru unele probe, care sunt foarte polare sau extrem de hidrofile, coloanele C18 obișnuite pot avea probleme atunci când sunt utilizate pentru a purifica astfel de probe. În RPC, solvenții de eluție utilizați în mod obișnuit pot fi ordonate în funcție de polaritatea lor: apa <metanol <acetonitril <etanol <tetrahidrofuran <izopropanol. Pentru a asigura o retenție bună pe coloană pentru aceste probe (puternic polar sau puternic hidrofil), este necesară o proporție ridicată a sistemului apos ca fază mobilă. Cu toate acestea, atunci când se utilizează un sistem de apă pură (inclusiv apă pură sau soluție de sare pură) ca fază mobilă, lanțul lung de carbon din faza staționară a coloanei C18 tinde să evite apa și să se amestece între ele, rezultând o scădere instantanee a capacității de retenție a coloanei sau chiar fără retenție. Acest fenomen se numește „prăbușire a fazei hidrofobe” (așa cum se arată în partea stângă a figurii 1). Deși această situație este reversibilă atunci când coloana este spălată cu solvenți organici, cum ar fi metanol sau acetonitril, poate provoca deteriorare coloanei. Prin urmare, este necesar să se prezinte această situație.
Figura 1. Diagrama schematică a fazelor legate pe suprafața silicagelului în coloana C18 obișnuită (stânga) și coloana C18AQ (dreapta).
Pentru a rezolva problemele menționate mai sus, producătorii de materiale de ambalare cromatografică au făcut îmbunătățiri tehnice. Una dintre aceste îmbunătățiri este efectuarea unor modificări pe suprafața matricei de silice, cum ar fi introducerea grupurilor ciano hidrofile (așa cum se arată în partea din dreapta a figurii 1), pentru a face suprafața gelului de silicagel mai hidrofil. Astfel, lanțurile C18 de pe suprafața de silice ar putea fi extinse complet în condiții extrem de apoase și s -ar putea evita prăbușirea fazei hidrofobe. Aceste coloane C18 modificate se numesc coloane apoase C18, și anume coloanele C18AQ, care sunt proiectate pentru condiții de eluție extrem de apoase și pot tolera un sistem apos 100%. Coloanele C18AQ au fost aplicate pe scară largă în separarea și purificarea compușilor polari puternici, inclusiv acizi organici, peptide, nucleozide și vitamine solubile în apă.
Desaltarea este una dintre aplicațiile tipice ale coloanelor C18AQ în purificarea flash pentru eșantioane, care elimină componentele de sare sau tampon din solventul de probă pentru a facilita aplicarea eșantionului în studiile ulterioare. În această postare, genialul FCF albastru cu polaritate puternică a fost utilizat ca eșantion și purificat pe coloana C18AQ. Solventul de probă a fost înlocuit cu solvent organic din soluție tampon, facilitând astfel următoarea evaporare rotativă, precum și economisirea solvenților și timpul de funcționare. Mai mult, puritatea eșantionului a fost îmbunătățită prin eliminarea unor impurități din eșantion.
Secțiune experimentală
Figura 2. Structura chimică a eșantionului.
FCF albastru strălucitor a fost utilizat ca eșantion în acest post. Puritatea eșantionului brut a fost de 86%, iar structura chimică a eșantionului a fost prezentată în figura 2. Pentru a pregăti soluția de probă, 300 mg solid brut cu pulbere de FCF albastru strălucitor a fost dizolvat într -o soluție tampon de 1 m NAH2PO4 și s -a zguduit bine pentru a deveni o soluție complet clară. Soluția de probă a fost apoi injectată în coloana flash de către un injector. Configurarea experimentală a purificării flash este listată în tabelul 1.
| Instrument | Mașină Sepabean ™2 | |||
| Cartușe | 12 g Sepaflash C18 RP Cartuș Flash (silice sferică, 20-45 μm, 100 Å, Număr de ordine: SW-5222-012-SP) | 12 g Sepaflash C18AQ RP Cartuș flash (silice sferică, 20-45 μm, 100 Å, număr de comandă ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Lungime de undă | 254 nm | |||
| Faza mobilă | Solvent o apă Solvent B ： Metanol | |||
| Debit | 30 ml/min | |||
| Încărcare a eșantionului | 300 mg (strălucitor FCF albastru cu puritatea de 86%) | |||
| Gradient | Timp (CV) | Solvent B (%) | Timp (CV) | Solvent B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultate și discuții
Pentru designarea și purificarea sepaflash C18AQ RP a fost utilizat pentru designarea și purificarea eșantionului. Gradientul de pas a fost utilizat în care a fost utilizată apă pură ca fază mobilă la începutul eluției și rulată pentru 10 volume de coloane (CV). Așa cum se arată în figura 3, atunci când se utilizează apă pură ca fază mobilă, proba a fost complet păstrată pe cartușul flash. În continuare, metanolul în faza mobilă a fost crescut direct la 100%, iar gradientul a fost menținut pentru 7,5 CV. Eșantionul a fost eluat de la 11,5 la 13,5 cv. În fracțiile colectate, soluția de probă a fost înlocuită de la soluția tampon NAH2PO4 la metanol. Comparativ cu o soluție extrem de apoasă, metanolul a fost mult mai ușor de îndepărtat prin evaporarea rotativă în etapa ulterioară, ceea ce facilitează următoarele cercetări.
Figura 3. Cromatograma flash a eșantionului pe un cartuș C18AQ.
Pentru a compara comportamentul de retenție al cartușului C18AQ și a cartușului C18 regulat pentru eșantioane de polaritate puternică, s -a efectuat un test de comparație paralelă. S -a utilizat un cartuș flash de sepaflash C18 RP și cromatograma flash pentru eșantion a fost prezentată în figura 4. Pentru cartușele C18 obișnuite, raportul de fază apos cu cel mai mare tolerat este de aproximativ 90%. Prin urmare, gradientul de pornire a fost stabilit la 10% metanol în 90% apă. Așa cum se arată în figura 4, datorită prăbușirii în faza hidrofobă a lanțurilor C18 cauzate de un raport apos ridicat, proba abia a fost păstrată pe cartușul C18 obișnuit și a fost eluat direct de faza mobilă. Drept urmare, nu poate fi finalizată funcționarea desaltării sau purificării eșantionului.
Figura 4. Cromatograma flash a eșantionului pe un cartuș C18 obișnuit.
Comparativ cu gradientul liniar, utilizarea gradientului de pas are următoarele avantaje:
1.. Utilizarea solventului și timpul de rulare pentru purificarea eșantionului este redus.
2. Produsul țintă se eluează într -un vârf ascuțit, ceea ce reduce volumul fracțiilor colectate și facilitează astfel următoarea evaporare rotativă, precum și economisirea timpului.
3. Produsul colectat este în metanol, care este ușor de evaporat, astfel timpul de uscare este redus.
În concluzie, pentru purificarea eșantionului care este puternic polară sau extrem de hidrofilă, sepaflash C18AQ RP Cartrogs Flash care se combină cu sistemul de cromatografie flash pregătitoare Sepabean ™ Mașina ar putea oferi o soluție rapidă și eficientă.
Despre cartușele Flash RP Sepaflash Seria C18 RP
Există o serie de cartușe Flash Sepaflash C18AQ RP cu specificații diferite de tehnologia Santai (așa cum se arată în tabelul 2).
| Numărul articolului | Dimensiunea coloanei | Debit (ml/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabelul 2. Sepaflash C18AQ RP Cartușe Flash.
Materiale de ambalare: silice obținută sferică de înaltă eficiență C18 (aq), 20-45 μm, 100 Å.
logy (așa cum se arată în tabelul 2).
Timpul post: 27-2018 august