Hongcheng Wang, Bo Xu
Centrul de cercetare și dezvoltare de aplicații
Introducere
În funcție de polaritățile relative ale fazei staționare și ale fazei mobile, cromatografia lichidă poate fi împărțită în cromatografia în fază normală (NPC) și cromatografia în fază inversă (RPC).Pentru RPC, polaritatea fazei mobile este mai puternică decât cea a fazei staționare.RPC a devenit cel mai utilizat în modurile de separare prin cromatografie lichidă datorită eficienței sale ridicate, rezoluției bune și mecanismului de reținere clar.Prin urmare, RPC este potrivit pentru separarea și purificarea diferiților compuși polari sau nepolari, inclusiv alcaloizi, carbohidrați, acizi grași, steroizi, acizi nucleici, aminoacizi, peptide, proteine etc. În RPC, faza staționară cel mai frecvent utilizată este matricea de silicagel care este legată cu diferite grupări funcționale, inclusiv C18, C8, C4, fenil, ciano, amino, etc. Dintre aceste grupări funcționale legate, cea mai utilizată este C18.Se estimează că mai mult de 80% din RPC utilizează acum faza legată C18.Prin urmare, coloana de cromatografie C18 a devenit o coloană universală obligatorie pentru fiecare laborator.
Deși coloana C18 poate fi utilizată într-o gamă foarte largă de aplicații, totuși, pentru unele probe care sunt foarte polare sau foarte hidrofile, coloanele C18 obișnuite pot avea probleme atunci când sunt utilizate pentru a purifica astfel de probe.În RPC, solvenții de eluare utilizați în mod obișnuit pot fi ordonați în funcție de polaritatea lor: apă < metanol < acetonitril < etanol < tetrahidrofuran < izopropanol.Pentru a asigura o reținere bună pe coloană pentru aceste probe (polare puternice sau foarte hidrofile), este necesară utilizarea unei proporții mari de sistem apos ca fază mobilă.Cu toate acestea, atunci când se utilizează un sistem de apă pură (inclusiv apă pură sau soluție de sare pură) ca fază mobilă, lanțul lung de carbon de pe faza staționară a coloanei C18 tinde să evite apa și să se amestece între ele, rezultând o scădere instantanee a capacitatea de reținere a coloanei sau chiar fără reținere.Acest fenomen se numește „colaps de fază hidrofobă” (așa cum se arată în partea din stânga a figurii 1).Deși această situație este reversibilă atunci când coloana este spălată cu solvenți organici, cum ar fi metanol sau acetonitril, totuși poate provoca deteriorarea coloanei.Prin urmare, este necesar să preveniți această situație.
Figura 1. Diagrama schematică a fazelor legate pe suprafața gelului de silice în coloana obișnuită C18 (stânga) și coloana C18AQ (dreapta).
Pentru a rezolva problemele menționate mai sus, producătorii de materiale de ambalare cromatografice au adus îmbunătățiri tehnice.Una dintre aceste îmbunătățiri este efectuarea unor modificări pe suprafața matricei de silice, cum ar fi introducerea de grupări ciano hidrofile (așa cum se arată în partea dreaptă a figurii 1), pentru a face suprafața gelului de silice mai hidrofilă.Astfel, lanțurile C18 de pe suprafața silicei ar putea fi extinse complet în condiții de mare apoasă și colapsul fazei hidrofobe ar putea fi evitată.Aceste coloane C18 modificate se numesc coloane C18 apoase, și anume coloane C18AQ, care sunt proiectate pentru condiții de eluare foarte apoasă și pot tolera un sistem apos 100%.Coloanele C18AQ au fost aplicate pe scară largă în separarea și purificarea compușilor polari puternici, inclusiv acizi organici, peptide, nucleozide și vitamine solubile în apă.
Desalinizarea este una dintre aplicațiile tipice ale coloanelor C18AQ în purificarea rapidă a probelor, care îndepărtează sarea sau componentele tampon din solventul probei pentru a facilita aplicarea probei în studiile ulterioare.În această postare, Brilliant Blue FCF cu polaritate puternică a fost folosit ca probă și purificat pe coloana C18AQ.Solventul eșantionului a fost înlocuit cu solvent organic din soluția tampon, facilitând astfel următoarea evaporare rotativă, precum și economisind solvenți și timp de operare.În plus, puritatea probei a fost îmbunătățită prin îndepărtarea unor impurități din eșantion.
Sectiunea Experimentala
Figura 2. Structura chimică a probei.
Brilliant Blue FCF a fost folosit ca eșantion în această postare.Puritatea probei brute a fost de 86%, iar structura chimică a probei a fost prezentată în Figura 2. Pentru a prepara soluția de probă, 300 mg de solid brut sub formă de pulbere de Brilliant Blue FCF au fost dizolvate în soluție tampon de NaH2PO4 1 M și s-au agitat bine pentru a deveni o soluție complet limpede.Soluția de probă a fost apoi injectată în coloana flash cu un injector.Configurația experimentală a purificării flash este listată în Tabelul 1.
| Instrument | Aparat SepaBean™2 | |||
| Cartușe | Cartuș flash SepaFlash C18 RP de 12 g (silice sferic, 20 - 45 μm, 100 Å, Număr comandă: SW-5222-012-SP) | Cartuș flash SepaFlash C18AQ RP 12 g (silice sferic, 20 - 45 μm, 100 Å, Număr comandă：SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Lungime de undă | 254 nm | |||
| Faza mobila | Solvent A: apă Solvent B: metanol | |||
| Debitul | 30 ml/min | |||
| Încărcarea probei | 300 mg (Brilliant Blue FCF cu puritate de 86%) | |||
| Gradient | Ora (CV) | Solvent B (%) | Ora (CV) | Solvent B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultate și discuții
Un cartuş flash SepaFlash C18AQ RP a fost utilizat pentru desalinizarea şi purificarea probei.S-a utilizat gradientul de etapă în care a fost utilizată apă pură ca fază mobilă la începutul eluției și a fost rulată pentru 10 volume de coloană (CV).După cum se arată în Figura 3, când se folosește apă pură ca fază mobilă, proba a fost reținută complet pe cartuşul flash.Apoi, metanolul din faza mobilă a fost crescut direct la 100% și gradientul a fost menținut timp de 7,5 CV.Proba a fost eluată de la 11,5 la 13,5 CV.În fracțiile colectate, soluția de probă a fost înlocuită din soluție tampon de NaH2PO4 în metanol.În comparație cu soluția foarte apoasă, metanolul a fost mult mai ușor de îndepărtat prin evaporare rotativă în etapa ulterioară, ceea ce facilitează cercetările următoare.
Figura 3. Cromatograma flash a probei pe un cartuş C18AQ.
Pentru a compara comportamentul de retenție al cartuşului C18AQ și al cartuşului C18 obișnuit pentru mostre cu polaritate puternică, a fost efectuat un test de comparare paralelă.A fost folosit un cartuş flash SepaFlash C18 RP şi cromatograma flash pentru probă a fost prezentată în Figura 4. Pentru cartuşele obişnuite C18, cel mai mare raport de fază apoasă tolerat este de aproximativ 90%.Prin urmare, gradientul de pornire a fost stabilit la 10% metanol în 90% apă.După cum se arată în Figura 4, din cauza colapsului fazei hidrofobe a lanțurilor C18 cauzată de raportul apos ridicat, proba abia a fost reținută pe cartuşul obișnuit C18 și a fost eluată direct de faza mobilă.Ca urmare, operațiunea de desalinizare sau purificare a probei nu poate fi finalizată.
Figura 4. Cromatograma flash a probei pe un cartuş C18 obişnuit.
În comparație cu gradientul liniar, utilizarea gradientului în trepte are următoarele avantaje:
1. Utilizarea solventului și timpul de funcționare pentru purificarea probei sunt reduse.
2. Produsul țintă eluează într-un vârf ascuțit, ceea ce reduce volumul fracțiilor colectate și astfel facilitează următoarea evaporare rotativă, precum și economisirea de timp.
3. Produsul colectat este în metanol care este ușor de evaporat, astfel se reduce timpul de uscare.
În concluzie, pentru purificarea probei care este puternic polară sau foarte hidrofilă, cartușele flash SepaFlash C18AQ RP combinate cu sistemul de cromatografie rapidă preparativă SepaBean™ Machine ar putea oferi o soluție rapidă și eficientă.
Despre cartușele flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Există o serie de cartușe flash SepaFlash C18AQ RP cu specificații diferite de la Santai Technology (după cum se arată în Tabelul 2).
| Numărul de articol | Dimensiunea coloanei | Debitul (ml/min) | Presiune max (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabelul 2. Cartușe flash SepaFlash C18AQ RP.
Materiale de ambalare: silice sferică C18(AQ) de înaltă eficiență, 20 - 45 μm, 100 Å.
(după cum se arată în Tabelul 2).
Ora postării: 27-aug-2018