Hongcheng Wang, Bo Xu
Centro de P&D do aplicativo
Introdução
De acordo com as polaridades relativas da fase estacionária e da fase móvel, a cromatografia líquida pode ser dividida em cromatografia em fase normal (NPC) e cromatografia de fase reversa (RPC). Para o RPC, a polaridade da fase móvel é mais forte que a da fase estacionária. O RPC se tornou o mais amplamente utilizado nos modos de separação de cromatografia líquida devido à sua alta eficiência, boa resolução e mecanismo de retenção clara. Therefore RPC is suitable for the separation and purification of various polar or non-polar compounds, including alkaloids, carbohydrates, fatty acids, steroids, nucleic acids, amino acids, peptides, proteins, etc. In RPC, the most commonly used stationary phase is the silica gel matrix which is bonded with various functional groups, including C18, C8, C4, phenyl, CIANO, amino, etc. Entre esses grupos funcionais ligados, o mais amplamente utilizado é C18. Estima -se que mais de 80% do RPC esteja agora usando a fase ligada C18. Portanto, a coluna de cromatografia C18 tornou-se uma coluna universal obrigatória para todos os laboratórios.
Embora a coluna C18 possa ser usada em uma ampla gama de aplicações, no entanto, para algumas amostras que são muito polares ou altamente hidrofílicas, as colunas C18 regulares podem ter problemas ao ser usada para purificar essas amostras. No RPC, os solventes de eluição comumente usados podem ser ordenados de acordo com sua polaridade: água <metanol <acetonitrila <etanol <tetra -hidrofurano <isopropanol. Para garantir uma boa retenção na coluna para essas amostras (fortes polares ou altamente hidrofílicas), é necessária alta proporção de sistema aquoso para ser usada como fase móvel. No entanto, ao usar o sistema de água pura (incluindo água pura ou solução de sal puro) como fase móvel, a cadeia de carbono longa na fase estacionária da coluna C18 tende a evitar a água e se misturar, resultando em uma diminuição instantânea na capacidade de retenção da coluna ou mesmo nenhuma retenção. Esse fenômeno é chamado de "colapso da fase hidrofóbica" (como mostrado na parte esquerda da Figura 1). Embora essa situação seja reversível quando a coluna é lavada com solventes orgânicos, como metanol ou acetonitrila, ela ainda pode causar danos à coluna. Portanto, é necessário impedir que essa situação aconteça.
Figura 1. O diagrama esquemático das fases ligadas na superfície do gel de sílica na coluna C18 regular (esquerda) e coluna C18AQ (direita).
Para resolver os problemas mencionados acima, os fabricantes de materiais de embalagem cromatográficos fizeram melhorias técnicas. Uma dessas melhorias é fazer algumas modificações na superfície da matriz de sílica, como a introdução de grupos ciano hidrofílicos (como mostrado na parte direita da Figura 1), para tornar a superfície do gel de sílica mais hidrofílica. Assim, as cadeias C18 na superfície da sílica podem ser totalmente estendidas sob condições altamente aquosas e o colapso da fase hidrofóbica pode ser evitado. Essas colunas C18 modificadas são chamadas de colunas aquosas C18, a saber, colunas C18AQ, que são projetadas para condições de etiqueta altamente aquosa e podem tolerar o sistema 100% aquoso. As colunas C18AQ têm sido amplamente aplicadas na separação e purificação de compostos polares fortes, incluindo ácidos orgânicos, peptídeos, nucleosídeos e vitaminas solúveis em água.
A dessalação é uma das aplicações típicas das colunas C18AQ na purificação flash para amostras, que remove os componentes de sal ou tampão no solvente da amostra para facilitar a aplicação da amostra em estudos subsequentes. Neste post, o brilhante FCF azul com forte polaridade foi usado como amostra e purificado na coluna C18AQ. O solvente de amostra foi substituído por solvente orgânico da solução tampão, facilitando assim a seguinte evaporação rotativa, além de economizar solventes e tempo de operação. Além disso, a pureza da amostra foi aprimorada removendo algumas impurezas na amostra.
Seção experimental
Figura 2. A estrutura química da amostra.
O brilhante FCF azul foi usado como amostra neste post. A pureza da amostra bruta foi de 86% e a estrutura química da amostra foi mostrada na Figura 2. Para preparar a solução da amostra, 300 mg de sólido bruto em pó de Blue FCF foi dissolvido em solução de tampão NAH2PO4 1 M e abalou bem para se tornar uma solução completamente clara. A solução de amostra foi então injetada na coluna Flash por um injetor. A configuração experimental da purificação do flash está listada na Tabela 1.
| Instrumento | Máquina Sepabean ™2 | |||
| Cartuchos | 12 g Sepaflash C18 RP Cartucho flash (sílica esférica, 20-45 μm, 100 Å, número de ordem: SW-5222-012-SP) | 12 g Sepaflash C18AQ RP Cartucho flash (sílica esférica, 20-45 μm, 100 Å, número do pedido: SW-5222-012-SP (aq)) | ||
| Comprimento de onda | 254 nm | |||
| Fase móvel | Solvente A ： Água Solvente B: metanol | |||
| Taxa de fluxo | 30 ml/min | |||
| Carregamento de amostra | 300 mg (brilhante FCF azul com a pureza de 86%) | |||
| Gradiente | Tempo (cv) | Solvente B (%) | Tempo (cv) | Solvente B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultados e discussão
Um cartucho flash sepaflash C18AQ RP foi usado para dessalação e purificação da amostra. O gradiente de etapa foi utilizado no qual a água pura foi usada como fase móvel no início da eluição e executada por 10 volumes de coluna (CV). Conforme mostrado na Figura 3, ao usar água pura como fase móvel, a amostra foi completamente retida no cartucho flash. Em seguida, o metanol na fase móvel foi aumentado diretamente para 100% e o gradiente foi mantido por 7,5 cv. A amostra foi eluída de 11,5 a 13,5 cv. Nas frações coletadas, a solução da amostra foi substituída da solução tampão Nah2PO4 para o metanol. Comparando com uma solução altamente aquosa, o metanol foi muito mais fácil de ser removido pela evaporação rotativa na etapa subsequente, o que facilita a pesquisa a seguir.
Figura 3. O cromatograma flash da amostra em um cartucho C18AQ.
Para comparar o comportamento de retenção do cartucho C18AQ e o cartucho C18 regular para amostras de forte polaridade, foi realizado um teste de comparação paralela. Foi utilizado um cartucho flash sepaflash C18 RP e o cromatograma flash para a amostra foi mostrado na Figura 4. Para cartuchos c18 regulares, a maior razão de fase aquosa tolerada é de cerca de 90%. Portanto, o gradiente de partida foi fixado em 10% de metanol em 90% de água. Como mostrado na Figura 4, devido ao colapso da fase hidrofóbica das cadeias C18 causadas pela alta proporção aquosa, a amostra mal foi retida no cartucho C18 regular e foi diretamente eluída pela fase móvel. Como resultado, a operação de dessalinização ou purificação da amostra não pode ser concluída.
Figura 4. O cromatograma flash da amostra em um cartucho C18 regular.
Comparando com o gradiente linear, o uso do gradiente de etapas tem as seguintes vantagens:
1. O uso do solvente e o tempo de execução para a purificação da amostra são reduzidos.
2. O produto alvo elui em um pico nítido, o que reduz o volume de frações coletadas e, portanto, facilita a seguinte evaporação rotativa e o tempo de economia.
3. O produto coletado está em metanol, que é fácil de ser evaporado, assim o tempo de secagem é reduzido.
Em conclusão, para a purificação da amostra que é fortemente polar ou altamente hidrofílica, os cartuchos flash rp sepaflash C18AQ que combinam com o sistema de cromatografia flash preparativa Sepabean ™ Machine poderia oferecer uma solução rápida e eficiente.
Sobre o Sepaflash Bonded Series C18 RP Flash Cartuchos
Há uma série de cartuchos flash sepaflash C18AQ RP com diferentes especificações da tecnologia Santai (como mostrado na Tabela 2).
| Número do item | Tamanho da coluna | Taxa de fluxo (ml/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabela 2. Sepaflash C18AQ RP Cartuchos flash.
Materiais de embalagem: sílica esférica de alta eficiência C18 (aq), 20-45 μm, 100 Å.
logy (como mostrado na Tabela 2).
Hora de postagem: 27-2018 de agosto