Hongcheng Wang, Bo Xu
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Introdução
De acordo com as polaridades relativas da fase estacionária e da fase móvel, a cromatografia líquida pode ser dividida em cromatografia de fase normal (NPC) e cromatografia de fase reversa (RPC).Para RPC, a polaridade da fase móvel é mais forte que a da fase estacionária.O RPC tornou-se o mais utilizado nos modos de separação por cromatografia líquida devido à sua alta eficiência, boa resolução e mecanismo de retenção claro.Portanto, o RPC é adequado para a separação e purificação de vários compostos polares ou não polares, incluindo alcalóides, carboidratos, ácidos graxos, esteróides, ácidos nucléicos, aminoácidos, peptídeos, proteínas, etc. No RPC, a fase estacionária mais comumente usada é a matriz de gel de sílica que está ligada a vários grupos funcionais, incluindo C18, C8, C4, fenil, ciano, amino, etc. Entre esses grupos funcionais ligados, o mais amplamente utilizado é o C18.Estima-se que mais de 80% dos RPC estejam agora usando a fase ligada C18.Portanto, a coluna de cromatografia C18 tornou-se uma coluna universal obrigatória para todos os laboratórios.
Embora a coluna C18 possa ser usada em uma ampla gama de aplicações, no entanto, para algumas amostras que são muito polares ou altamente hidrofílicas, as colunas C18 regulares podem ter problemas ao serem usadas para purificar tais amostras.No RPC, os solventes de eluição comumente usados podem ser ordenados de acordo com sua polaridade: água < metanol < acetonitrila < etanol < tetrahidrofurano < isopropanol.Para garantir uma boa retenção na coluna para essas amostras (polares fortes ou altamente hidrofílicas), é necessária uma alta proporção de sistema aquoso para ser usado como fase móvel.No entanto, ao usar o sistema de água pura (incluindo água pura ou solução salina pura) como fase móvel, a longa cadeia de carbono na fase estacionária da coluna C18 tende a evitar a água e se misturar, resultando em uma diminuição instantânea no capacidade de retenção da coluna ou mesmo sem retenção.Esse fenômeno é chamado de “colapso da fase hidrofóbica” (como mostrado na parte esquerda da Figura 1).Embora esta situação seja reversível quando a coluna é lavada com solventes orgânicos, como metanol ou acetonitrila, ela ainda pode causar danos à coluna.Portanto, é necessário evitar que essa situação aconteça.
Figura 1. O diagrama esquemático das fases ligadas na superfície do gel de sílica na coluna regular C18 (esquerda) e coluna C18AQ (direita).
Para resolver os problemas mencionados acima, os fabricantes de materiais de embalagem cromatográficos fizeram melhorias técnicas.Uma dessas melhorias é fazer algumas modificações na superfície da matriz de sílica, como a introdução de grupos ciano hidrofílicos (como mostrado na parte direita da Figura 1), para tornar a superfície da sílica gel mais hidrofílica.Assim, as cadeias C18 na superfície da sílica podem ser totalmente estendidas sob condições altamente aquosas e o colapso da fase hidrofóbica pode ser evitado.Essas colunas C18 modificadas são chamadas de colunas C18 aquosas, ou seja, colunas C18AQ, que são projetadas para condições de eluição altamente aquosas e podem tolerar um sistema 100% aquoso.As colunas C18AQ têm sido amplamente aplicadas na separação e purificação de compostos polares fortes, incluindo ácidos orgânicos, peptídeos, nucleosídeos e vitaminas solúveis em água.
A dessalinização é uma das aplicações típicas das colunas C18AQ na purificação flash de amostras, que remove os componentes de sal ou tampão no solvente da amostra para facilitar a aplicação da amostra em estudos posteriores.Neste post, o Brilliant Blue FCF com forte polaridade foi usado como amostra e purificado na coluna C18AQ.O solvente da amostra foi substituído por solvente orgânico da solução tampão, facilitando assim a seguinte rotaevaporação, bem como economizando solventes e tempo de operação.Além disso, a pureza da amostra foi melhorada pela remoção de algumas impurezas da amostra.
Secção experimental
Figura 2. A estrutura química da amostra.
O Brilliant Blue FCF foi usado como amostra neste post.A pureza da amostra bruta foi de 86% e a estrutura química da amostra foi mostrada na Figura 2. Para preparar a solução da amostra, 300 mg de sólido bruto em pó de Brilliant Blue FCF foi dissolvido em solução tampão NaH2PO4 1 M e agitou bem para se tornar uma solução completamente clara.A solução de amostra foi então injetada na coluna flash por um injetor.A configuração experimental da purificação flash está listada na Tabela 1.
| Instrumento | Máquina SepaBean™2 | |||
| Cartuchos | Cartucho de flash SepaFlash C18 RP de 12 g (sílica esférica, 20 - 45 μm, 100 Å, número do pedido: SW-5222-012-SP) | Cartucho de flash SepaFlash C18AQ RP de 12 g (sílica esférica, 20 - 45 μm, 100 Å, número do pedido: SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Comprimento de onda | 254 milhas náuticas | |||
| Na fase móvel | Solvente A: Água Solvente B: Metanol | |||
| Quociente de vazão | 30 ml/min | |||
| Carregamento de amostra | 300 mg (Brilliant Blue FCF com pureza de 86%) | |||
| Gradiente | Tempo (CV) | Solvente B (%) | Tempo (CV) | Solvente B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultados e discussão
Um cartucho flash SepaFlash C18AQ RP foi usado para dessalinização e purificação da amostra.O gradiente de etapas foi utilizado no qual água pura foi usada como fase móvel no início da eluição e corrida para 10 volumes de coluna (CV).Conforme mostrado na Figura 3, ao usar água pura como fase móvel, a amostra ficou totalmente retida no cartucho flash.Em seguida, o metanol na fase móvel foi aumentado diretamente para 100% e o gradiente foi mantido para 7,5 CV.A amostra foi eluída de 11,5 a 13,5 CV.Nas frações coletadas, a solução amostral foi substituída de solução tampão NaH2PO4 por metanol.Comparando com a solução altamente aquosa, o metanol foi muito mais fácil de ser removido por evaporação rotativa na etapa subsequente, o que facilita a próxima pesquisa.
Figura 3. O cromatograma flash da amostra em um cartucho C18AQ.
Para comparar o comportamento de retenção do cartucho C18AQ e do cartucho C18 regular para amostras de polaridade forte, foi realizado o teste de comparação paralela.Um cartucho flash SepaFlash C18 RP foi usado e o cromatograma flash para a amostra foi mostrado na Figura 4. Para cartuchos C18 regulares, a proporção de fase aquosa mais alta tolerada é de cerca de 90%.Portanto, o gradiente inicial foi definido em 10% de metanol em 90% de água.Conforme mostrado na Figura 4, devido ao colapso da fase hidrofóbica das cadeias C18 causado pela alta proporção aquosa, a amostra mal foi retida no cartucho C18 regular e foi eluída diretamente pela fase móvel.Como resultado, a operação de dessalinização ou purificação da amostra não pode ser concluída.
Figura 4. O cromatograma flash da amostra em um cartucho C18 comum.
Comparando com o gradiente linear, o uso do gradiente escalonado tem as seguintes vantagens:
1. O uso de solvente e o tempo de execução para a purificação da amostra são reduzidos.
2. O produto alvo elui em um pico agudo, o que reduz o volume das frações coletadas e, assim, facilita a evaporação rotativa seguinte, além de economizar tempo.
3. O produto coletado está em metanol que é facilmente evaporado, reduzindo assim o tempo de secagem.
Em conclusão, para a purificação da amostra que é fortemente polar ou altamente hidrofílica, os cartuchos flash SepaFlash C18AQ RP combinados com o sistema de cromatografia flash preparativa SepaBean™ Machine podem oferecer uma solução rápida e eficiente.
Sobre os cartuchos de flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Existe uma série de cartuchos flash SepaFlash C18AQ RP com especificações diferentes da Santai Technology (conforme tabela 2).
| Número de item | Tamanho da coluna | Quociente de vazão (mL/min) | Pressão máx. (psi/barra) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabela 2. Cartuchos flash SepaFlash C18AQ RP.
Materiais de embalagem: Sílica esférica C18(AQ) de alta eficiência, 20 - 45 μm, 100 Å.
logia (como mostrado na Tabela 2).
Horário da postagem: 27 de agosto de 2018