Mingzu Yang, Bo Xu
Centrum badawczo-rozwojowe aplikacji
Wstęp
Antybiotyki to klasa metabolitów wtórnych wytwarzanych przez mikroorganizmy (w tym bakterie, grzyby, promieniowce) lub podobne związki, które są syntetyzowane chemicznie lub półsyntetyzowane.Antybiotyki mogą hamować wzrost i przeżycie innych mikroorganizmów.Pierwszy antybiotyk odkryty przez człowieka, penicylina, został odkryty przez brytyjskiego mikrobiologa Alexandra Fleminga w 1928 roku. Zaobserwował on, że bakterie w pobliżu pleśni nie mogą rosnąć w zanieczyszczonej pleśnią szalce do hodowli gronkowców.Postulował, że pleśń musi wydzielać substancję przeciwbakteryjną, którą w 1928 roku nazwał penicyliną. Jednak składniki aktywne nie były wówczas oczyszczane.W 1939 roku Ernst Chain i Howard Florey z Uniwersytetu Oksfordzkiego postanowili opracować lek, który mógłby leczyć infekcje bakteryjne.Po skontaktowaniu się z Flemingiem w celu uzyskania szczepów pomyślnie wyekstrahowali i oczyścili ze szczepów penicylinę.Za pomyślny rozwój penicyliny jako leku terapeutycznego Fleming, Chain i Florey otrzymali w 1945 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny.
Antybiotyki są stosowane jako środki przeciwbakteryjne do leczenia lub zapobiegania infekcjom bakteryjnym.Istnieje kilka głównych kategorii antybiotyków stosowanych jako środki przeciwbakteryjne: antybiotyki β-laktamowe (w tym penicylina, cefalosporyna itp.), antybiotyki aminoglikozydowe, antybiotyki makrolidowe, antybiotyki tetracyklinowe, chloramfenikol (całkowicie syntetyczny antybiotyk) itp. Źródłami antybiotyków są m.in. fermentacja biologiczna, półsynteza i synteza całkowita.Antybiotyki wytwarzane w drodze fermentacji biologicznej muszą być strukturalnie modyfikowane metodami chemicznymi ze względu na stabilność chemiczną, toksyczne skutki uboczne, spektrum antybakteryjne i inne problemy.Po modyfikacji chemicznej antybiotyki mogły osiągnąć zwiększoną stabilność, zmniejszone toksyczne skutki uboczne, rozszerzone spektrum przeciwbakteryjne, zmniejszoną oporność na leki, lepszą biodostępność, a tym samym lepszy efekt leczenia lekiem.Dlatego też antybiotyki półsyntetyczne są obecnie najpopularniejszym kierunkiem rozwoju antybiotyków.
Podczas opracowywania antybiotyków półsyntetycznych antybiotyki charakteryzują się niską czystością, dużą ilością produktów ubocznych i złożonymi składnikami, ponieważ pochodzą z produktów fermentacji mikrobiologicznej.W tym przypadku szczególnie istotna jest analiza i kontrola zanieczyszczeń w antybiotykach półsyntetycznych.Aby skutecznie zidentyfikować i scharakteryzować zanieczyszczenia, konieczne jest uzyskanie wystarczającej ilości zanieczyszczeń z syntetycznego produktu, jakim są antybiotyki półsyntetyczne.Wśród powszechnie stosowanych technik przygotowania zanieczyszczeń, chromatografia typu flash jest metodą opłacalną, mającą takie zalety, jak duża ilość załadowanej próbki, niski koszt, oszczędność czasu itp. Chromatografia typu flash jest coraz częściej stosowana przez badaczy zajmujących się syntezą.
W tym poście główne zanieczyszczenie w postaci półsyntetycznego antybiotyku aminoglikozydowego wykorzystano jako próbkę i oczyszczono za pomocą wkładu SepaFlash C18AQ połączonego z maszyną SepaBean™ z systemem chromatografii typu flash.Udało się uzyskać docelowy produkt spełniający stawiane wymagania, co sugeruje wysoce efektywne rozwiązanie oczyszczania tych związków.
Sekcja Eksperymentalna
Próbkę udostępniła lokalna firma farmaceutyczna.Próbka była rodzajem aminopolicyklicznych węglowodanów i jej budowa molekularna była podobna do antybiotyków aminoglikozydowych.Polarność próbki była dość wysoka, co sprawiało, że była ona bardzo dobrze rozpuszczalna w wodzie.Schematyczny diagram struktury molekularnej próbki pokazano na rycinie 1. Czystość surowej próbki, jak analizowano metodą HPLC, wynosiła około 88%.Zgodnie z naszymi wcześniejszymi doświadczeniami, w przypadku oczyszczania tych związków o wysokiej polarności, próbka z trudem utrzymywałaby się na zwykłych kolumnach C18.Dlatego do oczyszczania próbki zastosowano kolumnę C18AQ.
Rysunek 1. Schematyczny diagram struktury molekularnej próbki.
Aby przygotować roztwór próbki, 50 mg surowej próbki rozpuszczono w 5 ml czystej wody, a następnie poddano działaniu ultradźwięków, aby stała się całkowicie klarownym roztworem.Następnie roztwór próbki wstrzyknięto do kolumny typu flash za pomocą iniektora.Układ eksperymentalny oczyszczania rzutowego przedstawiono w tabeli 1.
| Instrument | Maszyna SepaBean™ 2 | |
| Wkłady | Kartridż flash SepaFlash C18AQ RP 12 g (krzemionka sferyczna, 20 - 45 μm, 100 Å, numer zamówienia: SW-5222-012-SP(AQ)) | |
| Długość fali | 204 nm, 220 nm | |
| Faza mobilna | Rozpuszczalnik A: Woda Rozpuszczalnik B: Acetonitryl | |
| Przepływ | 15 ml/min | |
| Ładowanie próbki | 50 mg | |
| Gradient | Czas (min) | Rozpuszczalnik B (%) |
| 0 | 0 | |
| 19.0 | 8 | |
| 47,0 | 80 | |
| 52,0 | 80 | |
Wyniki i dyskusja
Chromatogram typu flash próbki na wkładzie C18AQ pokazano na rysunku 2. Jak pokazano na rysunku 2, silnie polarna próbka została skutecznie zatrzymana na wkładzie C18AQ.Po liofilizacji zebranych frakcji docelowy produkt miał czystość 96,2% (jak pokazano na Figurze 3) według analizy HPLC.Wyniki wykazały, że oczyszczony produkt może być dalej wykorzystany w kolejnym etapie badań i rozwoju.
Rysunek 2. Chromatogram typu flash próbki na wkładzie C18AQ.
Rysunek 3. Chromatogram HPLC produktu docelowego.
Podsumowując, wkład typu flash SepaFlash C18AQ RP w połączeniu z systemem chromatografii typu flash SepaBean™ może zaoferować szybkie i skuteczne rozwiązanie do oczyszczania wysoce polarnych próbek.
Informacje o kartridżach flash SepaFlash C18AQ RP
Istnieje seria wkładów flash SepaFlash C18AQ RP o różnych specyfikacjach firmy Santai Technology (jak pokazano w tabeli 2).
| Numer przedmiotu | Rozmiar kolumny | Przepływ (ml/min) | Maks. ciśnienie (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 gr | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 gr | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 gr | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 gr | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 gr | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 gr | 40-80 | 250/17,2 |
Tabela 2. Kartridże flash SepaFlash C18AQ RP.Materiały opakowaniowe: Wysokowydajna sferyczna krzemionka związana C18(AQ), 20 - 45 μm, 100 Å.
Dalsze informacje na temat szczegółowych specyfikacji maszyny SepaBean™ lub informacje dotyczące zamawiania kartridży flash z serii SepaFlash można znaleźć na naszej stronie internetowej.
Czas publikacji: 26 października 2018 r