
Rui Huang, bo xu
Centrum badań i rozwoju aplikacji
Wstęp
Chromatografia wymiany jonowej (IEC) jest metodą chromatograficzną powszechnie stosowaną do oddzielania i oczyszczania związków przedstawionych w postaci jonowej w roztworze. Zgodnie z różnymi stanami opłat wymiennych jonów, IEC można podzielić na dwa typy, chromatografię wymiany kationów i chromatografię wymiany anionowej. W chromatografii wymiany kationów grupy kwaśne są związane z powierzchnią pożywki separacji. Na przykład kwas sulfonowy (-SO3H) jest powszechnie stosowaną grupą w silnej wymianie kationów (SCX), która dysocjuje H+ i ujemnie naładowaną grupę -So3- może zatem adsorbować inne kationów w roztworze. W chromatografii wymiany anionowej grupy alkaliczne są związane z powierzchnią pożywki separacji. Na przykład czwartorzędowa amina (-NR3OH, gdzie R jest grupa węglowodorów) jest zwykle stosowana w silnej wymianie anionów (SAX), która dysocjacja OH- i pozytywnie naładowana grupa -N+R3 może adsorbować inne aniony w roztworze, co spowoduje efekt wymiany anionów.
Wśród naturalnych produktów flawonoidy przyciągnęły uwagę naukowców ze względu na ich rolę w zapobieganiu i leczeniu chorób sercowo -naczyniowych. Ponieważ cząsteczki flawonoidowe są kwaśne ze względu na obecność fenolowych grup hydroksylowych, chromatografia wymiany jonów jest alternatywną opcją oprócz konwencjonalnej chromatografii fazy normalnej lub odwrotnej fazy do rozdzielenia i oczyszczania tych kwaśnych związków. W chromatografii flash powszechnie stosowanym pożywką separacyjną do wymiany jonowej jest macierz żelu krzemionkowego, w której grupy wymiany jonów są związane z jej powierzchnią. Najczęściej stosowanymi trybami wymiany jonowej w chromatografii flash są SCX (zwykle grupa kwasu sulfonowego) i SAX (zwykle czwartorzędowa grupa aminy). W wcześniej opublikowanej notatce aplikacji z tytułem „Zastosowanie kolumn chromatograficznych o silnej wymianie kationowej w oczyszczeniu związków alkalicznych” przez Santai Technologies, kolumny SCX zastosowano do oczyszczania związków alkalicznych. W tym poście jako próbka zastosowano mieszaninę standardów neutralnych i kwaśnych do zbadania zastosowania kolumn SAX w oczyszczaniu kwaśnych związków.
Sekcja eksperymentalna
Ryc. 1. Schemat fazy stacjonarnej związanej z powierzchnią separacji SAX.
W tym poście zastosowano kolumnę SAX spakowaną z czwartorzędową krzemionką związaną z aminą (jak pokazano na rycinie 1). Mieszaninę chromonu i kwasu 2,4-dihydroksybenzoesowego zastosowano jako próbkę do oczyszczania (jak pokazano na rycinie 2). Mieszaninę rozpuszczono w metanolu i załadowano na wkład błyskowy przez wtryskiwacz. Eksperymentalna konfiguracja oczyszczania Flash jest wymieniona w tabeli 1.
Ryc. 2. Struktura chemiczna dwóch składników w mieszaninie próbki.
Instrument | Maszyna Sepabean ™ t | |||||
Wkłady | 4 g SEPAFLASH Standard Series Series Flash Case (nieregularna krzemionka, 40-63 μm, 60 Å, numer zamówienia: S-5101-0004) | 4 g SEPAFLASH SERIING SERIING SAX Flash Nabójca (nieregularna krzemionka, 40-63 μm, 60 Å, numer zamówienia : SW-5001-004-IR) | ||||
Długość fali | 254 nm (wykrywanie), 280 nm (monitorowanie) | |||||
Faza mobilna | Rozpuszczalnik A: N-heksan | |||||
Rozpuszczalnik B: octan etylu | ||||||
Natężenie przepływu | 30 ml/min | 20 ml/min | ||||
Ładowanie próbki | 20 mg (mieszanka komponentu A i komponentu B) | |||||
Gradient | Czas (CV) | Rozpuszczalnik B (%) | Czas (CV) | Rozpuszczalnik B (%) | ||
0 | 0 | 0 | 0 | |||
1.7 | 12 | 14 | 100 | |||
3.7 | 12 | / | / | |||
16 | 100 | / | / | |||
18 | 100 | / | / |
Wyniki i dyskusja
Po pierwsze, mieszaninę próbki oddzielono normalną fazową kasetą flash wstępnie wypełnioną zwykłą krzemionką. Jak pokazują na rycinie 3, dwa elementy w próbce elurowano z kasety jeden po drugim. Następnie do oczyszczenia próbki wykorzystano nabój SAX Flash. Jak pokazują na rycinie 4, komponent kwaśny B został całkowicie zatrzymany na wkładce SAX. Komponent neutralny A był stopniowo eluowany z kasety z elucją fazy ruchomej.
Rycina 3. Chromatogram flash próbki na zwykłej normalnej fazie.
Rycina 4. Chromatogram flash próbki na kasecie SAX.
Porównując ryc. 3 i ryc. 4, komponent A ma niespójny kształt szczytowy na dwóch różnych wkładach flash. Aby potwierdzić, czy szczyt elucji odpowiada komponentowi, możemy wykorzystać pełną funkcję skanowania długości fali, która jest wbudowana w oprogramowanie sterujące maszyny SEPABEAN ™. Otwórz dane eksperymentalne dwóch separacji, przeciągnij do linii wskaźnikowej na osi czasu (CV) w chromatogramie do najwyższego punktu i drugiego najwyższego punktu piku elucji odpowiadającego komponentowi A, a pełne widmo długości fali tych dwóch punktów będzie automatycznie pokazane poniżej chromatogramu (jak pokazano na rysunku 5 i rysunku 6). Porównując dane dotyczące pełnego widma długości fali tych dwóch separacji, składnik A ma spójny widmo absorpcji w dwóch eksperymentach. Z powodu komponentu A ma niespójny kształt szczytowy na dwóch różnych wkładach flash, spekuluje się, że w komponencie A jest specyficzne zanieczyszczenie A, które ma inną retencję na normalnej wkładu fazowym i wkładowi SAX. Dlatego sekwencja eluzyjna jest inna dla komponentu A i zanieczyszczenia tych dwóch wkładów flash, co powoduje niespójny kształt piku na chromatogramach.
Rycina 5. Pełne widmo długości fali komponentu A i zanieczyszczenia oddzielone kasetą fazową normalną.
Rycina 6. Pełne widmo długości fali komponentu A i zanieczyszczenia oddzielone kasetą SAX.
Jeśli produktem docelowym, który ma zostać zebrany, jest składnik neutralny A, zadanie oczyszczania można łatwo wykonać, używając bezpośredniego kasety SAX do elucji po załadowaniu próbki. Z drugiej strony, jeśli produktem docelowym, który ma zostać zebrany, jest komponent kwaśny B, sposób zwolnienia z przechwytywania można przyjąć z jedynie niewielką regulacją w etapach eksperymentalnych: Gdy próbka została załadowana na kasecie SAX, a składnik neutralny A został całkowicie wyeliminowany za pomocą rozpuszczalników organicznych w fazie normalnej fazy, przełącz mobilną fazę na metanol zawierający kwas 5%. Jony octanu w fazie mobilnej będą konkurować z składnikiem B o wiązanie z czwartorzędowymi grupami jonowymi jonowymi na fazie stacjonarnej kasety SAX, tym samym wykluczając komponent B z kasety w celu uzyskania produktu docelowego. Chromatogram próbki oddzielonej w trybie wymiany jonów pokazano na rycinie 7.
Ryc. 7. Chromatogram flash komponentu B eluowany w trybie wymiany jonowej na wkładce SAX.
Podsumowując, próbkę kwaśną lub neutralną można szybko oczyszczyć za pomocą kasety SAX w połączeniu z normalną fazą z wykorzystaniem różnych strategii oczyszczania. Ponadto, przy pomocy pełnej funkcji skanowania długości fali wbudowanej w oprogramowanie kontrolne maszyny Sepabean ™, charakterystyczne spektrum absorpcji frakcji eluowanych można łatwo porównać i potwierdzić, pomagając badaczom szybko określić skład i czystość eluowanych frakcji, a tym samym poprawić wydajność pracy.
Numer pozycji | Rozmiar kolumny | Natężenie przepływu (ML/min) | MAX. Pressure (psi/bar) |
SW-5001-004-IR | 5,9 g | 10-20 | 400/27,5 |
SW-5001-012-IR | 23 g | 15-30 | 400/27,5 |
SW-5001-025-IR | 38 g | 15-30 | 400/27,5 |
SW-5001-040-IR | 55 g | 20-40 | 400/27,5 |
SW-5001-080-IR | 122 g | 30-60 | 350/24.0 |
SW-5001-120-IR | 180 g | 40-80 | 300/20,7 |
SW-5001-220-IR | 340 g | 50-100 | 300/20,7 |
SW-5001-330-IR | 475 g | 50-100 | 250/17.2
|
Tabela 2. SEPAflash Series Series Sax Flash wkłady. Materiały opakowani: Ultra-Pure nieregularna krzemionka z wiązaniem SAX, 40-63 μm, 60 Å.
Więcej informacji na temat szczegółowych specyfikacji Sepabean ™Maszyna lub informacje o zamawianiu w SEPAFLASH Series Flash Flash, odwiedź naszą stronę internetową.
Czas postu: listopad 09-2018