Rui Huang, bo xu
Centrum badań i rozwoju aplikacji
Wstęp
Peptyd to związek złożony z aminokwasów, z których każdy ma unikalne właściwości fizyczne i chemiczne ze względu na różne typy i kolejność reszt aminokwasowych stanowiących jego sekwencję. Wraz z rozwojem syntezy chemicznej w fazie stałej poczyniła wielki postęp syntezy chemicznej różnych aktywnych peptydów. Jednak ze względu na skomplikowany skład peptydu uzyskanego przez syntezę fazy stałej, produkt końcowy należy oczyszczyć za pomocą wiarygodnych metod separacji. Powszechnie stosowane metody oczyszczania peptydów obejmują chromatografię wymiany jonowej (IEC) i wysokowydajne chromatografię cieczową (RP-HPLC), które mają wady niskiej pojemności ładowania próbki, wysokie koszty separacji, skomplikowane i kosztowne urządzenia separacji itp. W celu szybkiego oczyszczania małych cząsteczek peptydów (MW <1 KDA). Wkład SEPAFLASH RP C18 zastosowano do szybkiego oczyszczania grymopentyny (TP-5) i uzyskano produkt docelowy.
Rycina 1. 20 Wspólne aminokwasy (odtwarzane z www.bachem.com).
Istnieje 20 rodzajów aminokwasów, które są powszechne w składzie peptydów. Te aminokwasy można podzielić na następujące grupy zgodnie z ich polarnością i właściwością kwasowo-zasadową: niepolarne (hydrofobowe), polarne (nieładne), kwaśne lub podstawowe (jak pokazano na rycinie 1). W sekwencji peptydowej, jeśli aminokwasy stanowiące sekwencję są głównie polarne (jak zaznaczone w kolorze różowym na rycinie 1), takie jak cysteina, glutamina, asparagina, seryna, treonina, tyrozyna itp. Wówczas ten peptyd może mieć silną polarność i być wysoce rozpuszczalna w wodzie. Podczas procedury oczyszczania tych silnych próbek peptydu polarnego za pomocą chromatografii z odwróconą fazą wystąpi zjawisko zwane zawaleniem fazy hydrofobowej (patrz wcześniej opublikowana notatka zastosowania przez Santai Technologies: Hydrofobowa zawalenie fazy, kolumny chromatograficzne fazy AQ odwróconej fazy i ich zastosowania). W porównaniu ze zwykłymi kolumnami C18, ulepszone kolumny C18AQ są najbardziej odpowiednie do oczyszczania silnych próbek polarnych lub hydrofilowych. W tym poście silny peptyd polarny zastosowano jako próbkę i oczyszczono przez kolumnę C18AQ. W rezultacie docelowy produkt spełniający wymagania uzyskano i można go wykorzystać w następujących badaniach i rozwoju.
| Instrument | Sepabean™maszyna 2 | |||
| Wkłady | 12 g SEPAFLASH C18 RP Flash Nabójca (krzemionka sferyczna, 20–45 μm, 100 Å, zakonnik ： SW-5222-012-SP) | 12 g SEPAFLASH C18AQ RP Flash Nabójca (krzemionka sferyczna, 20-45 μm, 100 Å, numer zamówienia ： SW-5222-012-SP (AQ)) | ||
| Długość fali | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Faza mobilna | Rozpuszczalnik A: Woda Rozpuszczalnik B: Acetonitryl | |||
| Natężenie przepływu | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Ładowanie próbki | 30 mg | |||
| Gradient | Czas (CV) | Rozpuszczalnik B (%) | Czas (min) | Rozpuszczalnik B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Wyniki i dyskusja
Aby porównać wydajność oczyszczania próbki peptydu polarnego między zwykłą kolumną C18 a kolumną C18AQ, zastosowaliśmy zwykłą kolumnę C18 do oczyszczania próbki jako początek. Jak pokazano na rycinie 2, ze względu na zawalenie fazy hydrofobowej łańcuchów C18 spowodowanych wysokim stosunkiem wodnym, próbka ledwo zatrzymano na zwykłym najemniku C18 i była bezpośrednio eluowana przez fazę ruchomą. W rezultacie próbka nie została skutecznie rozdzielona i oczyszczona.
Ryc. 2. Chromatogram flash próbki na zwykłym wkładce C18.
Następnie użyliśmy kolumny C18AQ do oczyszczania próbki. Jak pokazano na rycinie 3, peptyd został skutecznie zatrzymany na kolumnie, a następnie eluowano. Produkt docelowy oddzielono od zanieczyszczeń w próbce surowej i zebrano. Po liofilizacji, a następnie przeanalizowaniu przez HPLC, oczyszczony produkt ma czystość 98,2% i może być dalej wykorzystywany do badań i rozwoju następnego etapu.
Rysunek 3. Chromatogram flash próbki na wkładce C18AQ.
Podsumowując, kaseta flash SEPAFLASH C18AQ RP w połączeniu z systemem chromatografii flash sepabean™Maszyna może oferować szybkie i skuteczne rozwiązanie do oczyszczania silnych próbek polarnych lub hydrofilowych.
Istnieje seria kaset flash SEPAFLASH C18AQ RP z różnymi specyfikacjami z technologii Santai (jak pokazano w tabeli 2).
| Numer pozycji | Rozmiar kolumny | Natężenie przepływu (ML/min) | MAX. Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabela 2. SEPAFLASH C18AQ RP Flash Wkłady. Materiały opakowani: krzemionka z kulistą wysokowydajną C18 (AQ), 20–45 μm, 100 Å.
Więcej informacji na temat szczegółowych specyfikacji maszyny SEPABEAN ™ lub informacji o zamawianiu w SEPAFLASH Series Flash Flash, odwiedź naszą stronę internetową.
Czas po: 12-2018 października