Hongcheng Wang, bo xu
Centrum badań i rozwoju aplikacji
Wstęp
Zgodnie ze względnymi polaryzmami fazy stacjonarnej i fazy ruchomej chromatografia cieczowa można podzielić na chromatografię fazową normalną (NPC) i chromatografię fazową odwróconą (RPC). W przypadku RPC polaryzacja fazy ruchomej jest silniejsza niż w fazie stacjonarnej. RPC stało się najczęściej stosowanym w trybach separacji chromatografii cieczowej ze względu na wysoką wydajność, dobrą rozdzielczość i wyraźny mechanizm retencji. Dlatego RPC nadaje się do rozdzielenia i oczyszczania różnych związków polarnych lub niepolarnych, w tym alkaloidów, węglowodanów, kwasów tłuszczowych, sterydów, kwasów nukleinowych, aminokwasów, peptydów, białek itp. W RPC, najczęściej stosowaną fazą stacjonarną jest matrycy gelowej krzemionki, która jest wiążąca z różnymi grupami funkcjonalnymi, C1, C4, C4, fenyl, fenyl, fenyl, fenyl, fenyl. Amino itp. Wśród tych połączonych grup funkcjonalnych najczęściej używanym jest C18. Szacuje się, że ponad 80% RPC stosuje teraz fazę związaną z C18. Dlatego kolumna chromatografii C18 stała się niezbędną uniwersalną kolumną dla każdego laboratorium.
Chociaż kolumna C18 może być stosowana w bardzo szerokim zakresie zastosowań, w przypadku niektórych próbek, które są bardzo polarne lub wysoce hydrofilowe, regularne kolumny C18 mogą mieć problemy przy użyciu do oczyszczania takich próbek. W RPC powszechnie stosowane rozpuszczalniki elucji można zamówić zgodnie z ich polaryzmem: woda <metanol <acetonitryl <etanol <tetrahydrofuran <izopropanol. Aby zapewnić dobrą retencję w kolumnie dla tych próbek (silny polarny lub wysoce hydrofilowy), jako faza mobilna konieczna jest wysoka proporcja systemu wodnego. Jednak przy użyciu systemu czystej wody (w tym czystej lub czystej roztworu soli) jako fazy ruchomej długi łańcuch węglowy na fazie stacjonarnej kolumny C18 ma tendencję do unikania wody i mieszania się ze sobą, co powoduje natychmiastowe zmniejszenie zdolności zatrzymywania kolumny, a nawet bez zatrzymania. Zjawisko to nazywa się „zapadnięciem fazy hydrofobowej” (jak pokazano w lewej części ryc. 1). Chociaż sytuacja ta jest odwracalna, gdy kolumna jest przemyta rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak metanol lub acetonitryl, nadal może powodować uszkodzenie kolumny. Dlatego konieczne jest zapobieganie tej sytuacji.
Ryc. 1. Schemat schematów związanych faz na powierzchni żelu krzemionkowego w zwykłej kolumnie C18 (po lewej) i kolumnie C18AQ (po prawej).
Aby rozwiązać wyżej wymienione problemy, producenci materiałów do opakowania chromatograficznego dokonali ulepszeń technicznych. Jedną z tych ulepszeń jest wprowadzenie pewnych modyfikacji na powierzchni matrycy krzemionkowej, takie jak wprowadzenie hydrofilowych grup cyjano (jak pokazano w prawej części ryc. 1), aby powierzchnia żelu krzemionkowego była bardziej hydrofilowa. Zatem łańcuchy C18 na powierzchni krzemionki można w pełni przedłużyć w wysoce wodnych warunkach i można było uniknąć zapadnięcia się fazy hydrofobowej. Te zmodyfikowane kolumny C18 nazywane są wodnymi kolumnami C18, a mianowicie kolumn C18AQ, które są przeznaczone do wysoce wodnych warunków elucji i mogą tolerować 100% wodny układ. Kolumny C18AQ zostały szeroko stosowane w separacji i oczyszczaniu silnych związków polarnych, w tym kwasów organicznych, peptydów, nukleozydów i witamin rozpuszczalnych w wodzie.
Dezalowanie jest jednym z typowych zastosowań kolumn C18AQ w oczyszczaniu Flash dla próbek, co usuwa składniki soli lub bufora w rozpuszczalniku próbki, aby ułatwić zastosowanie próbki w kolejnych badaniach. W tym poście jako próbkę zastosowano błyskotliwą niebieską FCF o silnej polaryzacji i oczyszczono w kolumnie C18AQ. Rozpuszczalnik próbki został zastąpiony przez rozpuszczalnik organiczny z roztworu buforowego, ułatwiając w ten sposób następujące odparowanie obrotowe, a także oszczędzając rozpuszczalniki i czas pracy. Ponadto czystość próbki poprawiono poprzez usunięcie niektórych zanieczyszczeń w próbce.
Sekcja eksperymentalna
Ryc. 2. Struktura chemiczna próbki.
Genialny niebieski FCF zastosowano jako próbkę w tym poście. Czystość surowej próbki wynosiła 86%, a strukturę chemiczną próbki pokazano na rycinie 2. Aby przygotować roztwór próbki, 300 mg surowe surowe stałe z genialnego niebieskiego FCF rozpuszczono w roztworze buforowym 1 M NaH2PO4 i dobrze się wstrząsnęła, aby stać się całkowicie wyraźnym roztworem. Roztwór próbki następnie wstrzyknięto do kolumny Flash za pomocą wtryskiwacza. Eksperymentalna konfiguracja oczyszczania Flash jest wymieniona w tabeli 1.
| Instrument | Maszyna SEPABEAN ™2 | |||
| Wkłady | 12 g SEPAFLASH C18 RP Flash Nabójca (krzemionka sferyczna, 20-45 μm, 100 Å, numer zamówienia: SW-5222-012-SP) | 12 g SEPAFLASH C18AQ RP Flash Nabójca (krzemionka sferyczna, 20-45 μm, 100 Å, numer zamówienia ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Długość fali | 254 nm | |||
| Faza mobilna | Rozpuszczalnik A ： Woda Rozpuszczalnik B ： Metanol | |||
| Natężenie przepływu | 30 ml/min | |||
| Ładowanie próbki | 300 mg (genialny niebieski FCF z czystością 86%) | |||
| Gradient | Czas (CV) | Rozpuszczalnik B (%) | Czas (CV) | Rozpuszczalnik B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Wyniki i dyskusja
Do odsalania i oczyszczania próbki zastosowano nabój flash SEPAFLASH C18AQ RP. Zastosowano gradient kroku, w którym czystą wodę zastosowano jako fazę ruchomą na początku elucji i uruchomiła się dla 10 kolumn (CV). Jak pokazano na ryc. 3, przy użyciu czystej wody jako fazy ruchomej próbka została całkowicie zatrzymana na wkładce flash. Następnie metanol w fazie ruchomej zwiększono bezpośrednio do 100%, a gradient utrzymywano dla 7,5 cv. Próbkę eluowano z 11,5 do 13,5 cv. W zebranych frakcjach roztwór próbki zastąpiono z roztworu bufora NaH2PO4 na metanolu. W porównaniu z wysoce wodnym roztworem metanol był znacznie łatwiejszy do usunięcia przez odparowanie obrotowe w kolejnym etapie, co ułatwia następujące badania.
Rysunek 3. Chromatogram flash próbki na wkładce C18AQ.
Aby porównać zachowanie retencyjne wkładu C18AQ i zwykłej wkładu C18 dla próbek silnej polaryzacji, przeprowadzono równoległy test porównawczy. Zastosowano kasetę błyskową SEPAFLASH C18 RP, a chromatogram flash dla próbki pokazano na rycinie 4. W przypadku zwykłych wkładów C18 najwyższy tolerowany stosunek fazy wodnej wynosi około 90%. Dlatego gradient startowy ustawiono na 10% metanolu w 90% wodzie. Jak pokazano na rycinie 4, ze względu na hydrofobowy zawalenie się fazy łańcuchów C18 spowodowany wysokim stosunkiem wodnym, próbka ledwo zatrzymano na zwykłym najemniku C18 i była bezpośrednio eluowana przez fazę ruchomą. W rezultacie nie można ukończyć działania odsalania lub oczyszczania próbki.
Rycina 4. Chromatogram flash próbki na zwykłym naboźnie C18.
W porównaniu z gradientem liniowym zastosowanie gradientu Step ma następujące zalety:
1. Zastosowanie rozpuszczalnika i czas wykonywania oczyszczania próbki jest skrócony.
2. Produkt docelowy elutuje w ostrym szczycie, który zmniejsza objętość zebranych frakcji, a tym samym ułatwia następujące obrotowe odparowanie, a także oszczędzanie czasu.
3. Zebrany produkt znajduje się w metanolu, który jest łatwy do odparowania, a zatem czas suszenia jest skrócony.
Podsumowując, w przypadku oczyszczania próbki, która jest silnie polarna lub wysoce hydrofilowa, kasety flash SEPAFLASH C18AQ RP w połączeniu z preparatywnym systemem chromatografii flash Sepabean ™ Maszyna może oferować szybkie i wydajne rozwiązanie.
O SEPAFLASH BONDED SERIINE C18 RP WARTRIDGES
Istnieje seria kaset flash SEPAFLASH C18AQ RP z różnymi specyfikacjami z technologii Santai (jak pokazano w tabeli 2).
| Numer pozycji | Rozmiar kolumny | Natężenie przepływu (ML/min) | MAX. Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabela 2. SEPAFLASH C18AQ RP Flash Wkłady.
Materiały opakowani: krzemionka z kulistą wysokowydajną C18 (AQ), 20–45 μm, 100 Å.
Logy (jak pokazano w tabeli 2).
Czas postu: 27-2018