Hongcheng Wang, Bo Xu
Centrum badawczo-rozwojowe aplikacji
Wstęp
Zgodnie z względnymi polarnościami fazy stacjonarnej i ruchomej chromatografię cieczową można podzielić na chromatografię w fazie normalnej (NPC) i chromatografię w układzie faz odwróconych (RPC).W przypadku RPC polaryzacja fazy ruchomej jest silniejsza niż fazy stacjonarnej.RPC stał się najczęściej stosowanym w trybach separacji metodą chromatografii cieczowej ze względu na wysoką wydajność, dobrą rozdzielczość i przejrzysty mechanizm retencji.Dlatego RPC nadaje się do rozdzielania i oczyszczania różnych polarnych lub niepolarnych związków, w tym alkaloidów, węglowodanów, kwasów tłuszczowych, steroidów, kwasów nukleinowych, aminokwasów, peptydów, białek itp. W RPC najczęściej stosowaną fazą stacjonarną jest matryca z żelu krzemionkowego, która jest związana z różnymi grupami funkcyjnymi, w tym C18, C8, C4, fenylem, cyjanami, aminami itp. Wśród tych związanych grup funkcyjnych najczęściej stosowaną jest C18.Szacuje się, że ponad 80% RPC wykorzystuje obecnie fazę związaną C18.Dlatego kolumna chromatograficzna C18 stała się uniwersalną kolumną niezbędną w każdym laboratorium.
Chociaż kolumna C18 może być używana w bardzo szerokim zakresie zastosowań, jednak w przypadku niektórych próbek, które są bardzo polarne lub wysoce hydrofilowe, zwykłe kolumny C18 mogą mieć problemy podczas stosowania do oczyszczania takich próbek.W RPC powszechnie stosowane rozpuszczalniki elucyjne można uporządkować według ich polarności: woda < metanol < acetonitryl < etanol < tetrahydrofuran < izopropanol.Aby zapewnić dobrą retencję na kolumnie dla tych próbek (silnie polarnych lub silnie hydrofilowych), konieczne jest zastosowanie dużej ilości układu wodnego jako fazy ruchomej.Jednakże, gdy jako fazę ruchomą używany jest system czystej wody (w tym czysta woda lub czysty roztwór soli), długi łańcuch węglowy na fazie stacjonarnej kolumny C18 ma tendencję do unikania wody i mieszania się ze sobą, co powoduje natychmiastowy spadek zdolność retencyjną kolumny lub nawet brak retencji.Zjawisko to nazywane jest „załamaniem fazy hydrofobowej” (jak pokazano w lewej części ryciny 1).Chociaż sytuacja ta jest odwracalna po przemyciu kolumny rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak metanol lub acetonitryl, nadal może spowodować uszkodzenie kolumny.Dlatego konieczne jest zapobieganie takiej sytuacji.
Rycina 1. Schematyczny diagram faz związanych na powierzchni żelu krzemionkowego w kolumnie regularnej C18 (po lewej) i kolumnie C18AQ (po prawej).
Aby rozwiązać wyżej wymienione problemy, producenci chromatograficznych materiałów wypełniających wprowadzili udoskonalenia techniczne.Jednym z tych ulepszeń jest dokonanie pewnych modyfikacji na powierzchni matrycy krzemionkowej, takich jak wprowadzenie hydrofilowych grup cyjanowych (jak pokazano w prawej części rysunku 1), aby powierzchnia żelu krzemionkowego była bardziej hydrofilowa.W ten sposób łańcuchy C18 na powierzchni krzemionki mogą być całkowicie rozciągnięte w silnie uwodnionych warunkach i można uniknąć załamania fazy hydrofobowej.Te zmodyfikowane kolumny C18 nazywane są wodnymi kolumnami C18, mianowicie kolumnami C18AQ, które są zaprojektowane do wysoce wodnych warunków elucji i mogą tolerować 100% układ wodny.Kolumny C18AQ znalazły szerokie zastosowanie w separacji i oczyszczaniu silnych związków polarnych, w tym kwasów organicznych, peptydów, nukleozydów i witamin rozpuszczalnych w wodzie.
Odsalanie jest jednym z typowych zastosowań kolumn C18AQ w oczyszczaniu typu flash próbek, które usuwa sole lub składniki buforu z rozpuszczalnika próbki w celu ułatwienia zastosowania próbki w kolejnych badaniach.W tym poście Brilliant Blue FCF o silnej polarności został użyty jako próbka i oczyszczony na kolumnie C18AQ.Rozpuszczalnik próbki zastąpiono rozpuszczalnikiem organicznym z roztworu buforowego, ułatwiając w ten sposób następujące po nim odparowanie na wyparce obrotowej, a także oszczędzając rozpuszczalniki i czas pracy.Ponadto czystość próbki została poprawiona poprzez usunięcie niektórych zanieczyszczeń z próbki.
Sekcja Eksperymentalna
Rysunek 2. Struktura chemiczna próbki.
Brilliant Blue FCF został użyty jako próbka w tym poście.Czystość surowej próbki wynosiła 86%, a strukturę chemiczną próbki przedstawiono na rycinie 2. Aby przygotować roztwór próbki, 300 mg sproszkowanej surowej substancji stałej Błękitu Brylantowego FCF rozpuszczono w 1 M roztworze buforowym NaH2PO4 i dobrze wstrząśnięto, aby uzyskać zupełnie jasne rozwiązanie.Roztwór próbki wstrzyknięto następnie do kolumny rzutowej za pomocą wtryskiwacza.Eksperymentalny układ oczyszczania błyskawicznego przedstawiono w Tabeli 1.
| Instrument | Maszyna SepaBean™2 | |||
| Naboje | Wkład flash SepaFlash C18 RP 12 g (krzemionka sferyczna, 20–45 μm, 100 Å, numer zamówienia: SW-5222-012-SP) | Wkład flash SepaFlash C18AQ RP 12 g (krzemionka sferyczna, 20–45 μm, 100 Å, numer zamówienia: SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Długość fali | 254 nm | |||
| Faza mobilna | Rozpuszczalnik A: woda Rozpuszczalnik B: metanol | |||
| Przepływ | 30 ml/min | |||
| Ładowanie próbki | 300 mg (Błękit Brylantowy FCF o czystości 86%) | |||
| Gradient | Czas (CV) | Rozpuszczalnik B (%) | Czas (CV) | Rozpuszczalnik B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17,5 | 100 | 17,5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Wyniki i dyskusja
Do odsalania i oczyszczania próbek użyto kasety flash SepaFlash C18AQ RP.Zastosowano stopniowy gradient, w którym jako fazę ruchomą użyto czystej wody na początku elucji i prowadzono przez 10 objętości kolumny (CV).Jak pokazano na rycinie 3, przy użyciu czystej wody jako fazy ruchomej próbka została całkowicie zatrzymana na wkładzie flash.Następnie zawartość metanolu w fazie ruchomej zwiększono bezpośrednio do 100% i utrzymano gradient przez 7,5 CV.Próbkę eluowano od 11,5 do 13,5 CV.W zebranych frakcjach roztwór próbki zastąpiono roztworem buforowym NaH2PO4 na metanol.W porównaniu z roztworem silnie uwodnionym, metanol był znacznie łatwiejszy do usunięcia na wyparce obrotowej w kolejnym etapie, co ułatwia dalsze badania.
Rysunek 3. Chromatogram flash próbki na kartridżu C18AQ.
Aby porównać zachowanie retencji wkładu C18AQ i zwykłego wkładu C18 dla próbek o silnej polaryzacji, przeprowadzono test porównania równoległego.Zastosowano kartridż flash SepaFlash C18 RP, a chromatogram flash dla próbki przedstawiono na rycinie 4. W przypadku zwykłych kartridży C18 najwyższy tolerowany stosunek fazy wodnej wynosi około 90%.Dlatego początkowy gradient ustalono na 10% metanolu w 90% wodzie.Jak pokazano na fig. 4, z powodu załamania się fazy hydrofobowej łańcuchów C18 spowodowanego wysokim stosunkiem wody, próbka ledwo utrzymywała się na zwykłym wkładzie C18 i była bezpośrednio eluowana przez fazę ruchomą.W rezultacie operacja odsalania lub oczyszczania próbki nie może zostać zakończona.
Rysunek 4. Chromatogram typu flash próbki na zwykłym wkładzie C18.
W porównaniu z gradientem liniowym zastosowanie gradientu stopniowego ma następujące zalety:
1. Zmniejsza się zużycie rozpuszczalnika i czas pracy podczas oczyszczania próbki.
2. Docelowy produkt eluuje w ostrym piku, co zmniejsza objętość zbieranych frakcji, a tym samym ułatwia późniejsze odparowanie obrotowe oraz oszczędza czas.
3. Zebrany produkt znajduje się w metanolu, który łatwo odparowuje, co skraca czas suszenia.
Podsumowując, w przypadku oczyszczania próbek, które są silnie polarne lub wysoce hydrofilowe, szybkie i wydajne rozwiązanie mogą zapewnić kasety flash SepaFlash C18AQ RP w połączeniu z systemem preparatywnej chromatografii błyskawicznej SepaBean™ Machine.
O wkładach flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Istnieje seria kartridży flash SepaFlash C18AQ RP o różnych specyfikacjach od Santai Technology (jak pokazano w Tabeli 2).
| Numer przedmiotu | Rozmiar kolumny | Przepływ (ml/min) | Maks. ciśnienie (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 grama | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 gr | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 gr | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 gr | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 gr | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 gr | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 gr | 40-80 | 250/17,2 |
Tabela 2. Wkłady flash SepaFlash C18AQ RP.
Materiały opakowaniowe: Wysokowydajna sferyczna krzemionka związana C18(AQ), 20 - 45 μm, 100 Å.
logika (jak pokazano w Tabeli 2).
Czas postu: 27-08-2018