Rui Huang, Bo Xu
Søknads FoU-senter
Introduksjon
Et peptid er en forbindelse sammensatt av aminosyrer, som hver har unike fysiske og kjemiske egenskaper på grunn av de forskjellige typene og rekkefølgen av aminosyrerester som utgjør sekvensen.Med utviklingen av fastfase kjemisk syntese har den kjemiske syntesen av forskjellige aktive peptider gjort store fremskritt.Men på grunn av den kompliserte sammensetningen av peptidet oppnådd ved fastfasesyntese, bør sluttproduktet renses ved pålitelige separasjonsmetoder.De vanligste rensemetodene for peptider inkluderer ionebytterkromatografi (IEC) og revers-fase høyytelses væskekromatografi (RP-HPLC), som har ulempene med lav prøvekapasitet, høye kostnader for separasjonsmedier, komplisert og kostbart separasjonsutstyr, etc. For rask rensing av småmolekylære peptider (MW < 1 kDa), ble det tidligere publisert en vellykket søknadssak av Santai Technologies, der en SepaFlash RP C18-patron ble brukt for rask rensing av thymopentin (TP-5) og målprodukt som oppfyller kravene ble oppnådd.
Figur 1. 20 vanlige aminosyrer (gjengitt fra www.bachem.com).
Det er 20 typer aminosyrer som er vanlige i sammensetningen av peptider.Disse aminosyrene kan deles inn i følgende grupper i henhold til deres polaritet og syre-base-egenskap: ikke-polare (hydrofob), polare (uladet), sur eller basisk (som vist i figur 1).I en peptidsekvens, hvis aminosyrene som utgjør sekvensen for det meste er polare (som markert med rosa farge i figur 1), slik som cystein, glutamin, asparagin, serin, treonin, tyrosin osv., kan dette peptidet ha en sterk polaritet og være svært løselig i vann.Under renseprosedyren for disse sterke polare peptidprøvene ved omvendt-fase-kromatografi, vil et fenomen som kalles hydrofob fasekollaps oppstå (se en tidligere publisert søknadsnotat av Santai Technologies: Hydrophobic Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).Sammenlignet med de vanlige C18 kolonnene, er de forbedrede C18AQ kolonnene mest egnet for rensing av sterke polare eller hydrofile prøver.I dette innlegget ble et sterkt polart peptid brukt som prøven og renset av en C18AQ-kolonne.Som et resultat ble målproduktet som oppfyller kravene oppnådd og kunne brukes i følgende forskning og utvikling.
| Instrument | SepaBean™maskin 2 | |||
| Patroner | 12 g SepaFlash C18 RP flash-patron (sfærisk silika, 20 - 45 μm, 100 Å, bestillingsnummer: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP-blitskassett (sfærisk silika, 20 - 45 μm, 100 Å, bestillingsnummer：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Bølgelengde | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobil fase | Løsemiddel A: Vann Løsningsmiddel B: Acetonitril | |||
| Strømningshastighet | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Prøvelasting | 30 mg | |||
| Gradient | Tid (CV) | Løsemiddel B (%) | Tid (min) | Løsemiddel B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10,0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29,0 | 87 | |||
Resultater og diskusjon
For å sammenligne renseytelsen for den polare peptidprøven mellom vanlig C18-kolonne og C18AQ-kolonne, brukte vi en vanlig C18-kolonne for flashrensing av prøven som en start.Som vist i figur 2, på grunn av den hydrofobe fasekollapsen av C18-kjedene forårsaket av høyt vannforhold, ble prøven knapt holdt tilbake på den vanlige C18-patronen og ble direkte eluert ut av den mobile fasen.Som et resultat ble prøven ikke effektivt separert og renset.
Figur 2. Flashkromatogrammet til prøven på en vanlig C18 patron.
Deretter brukte vi en C18AQ-kolonne for flashrensing av prøven.Som vist i figur 3 ble peptidet effektivt holdt tilbake på kolonnen og deretter eluert ut.Målproduktet ble separert fra urenhetene i råprøven og samlet.Etter lyofilisering og deretter analysert ved HPLC, har det rensede produktet en renhet på 98,2 % og kan brukes videre til neste trinn i forskning og utvikling.
Figur 3. Flashkromatogrammet til prøven på en C18AQ-patron.
Som konklusjon, SepaFlash C18AQ RP blitskassett kombinert med flashkromatografisystemet SepaBean™maskinen kan tilby en rask og effektiv løsning for rensing av sterke polare eller hydrofile prøver.
Det finnes en serie SepaFlash C18AQ RP-blitskassetter med forskjellige spesifikasjoner fra Santai Technology (som vist i tabell 2).
| Artikkelnummer | Kolonnestørrelse | Strømningshastighet (ml/min) | Maks. trykk (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabell 2. SepaFlash C18AQ RP flash-kassetter.Emballasjematerialer: Høyeffektiv sfærisk C18(AQ)-bundet silika, 20 - 45 μm, 100 Å.
For ytterligere informasjon om detaljerte spesifikasjoner for SepaBean™-maskinen, eller bestillingsinformasjon om SepaFlash-seriens flashkassetter, vennligst besøk vår nettside.
Innleggstid: 12-okt-2018