Hongcheng Wang, Bo Xu
Søknads FoU-senter
Introduksjon
I henhold til de relative polaritetene til stasjonær fase og mobil fase, kan væskekromatografi deles inn i normalfasekromatografi (NPC) og reversfasekromatografi (RPC).For RPC er polariteten til den mobile fasen sterkere enn den til den stasjonære fasen.RPC har blitt den mest brukte i væskekromatografiseparasjonsmoduser på grunn av sin høye effektivitet, gode oppløsning og klare retensjonsmekanisme.Derfor er RPC egnet for separasjon og rensing av ulike polare eller ikke-polare forbindelser, inkludert alkaloider, karbohydrater, fettsyrer, steroider, nukleinsyrer, aminosyrer, peptider, proteiner osv. I RPC er den mest brukte stasjonære fasen. silikagelmatrisen som er bundet med forskjellige funksjonelle grupper, inkludert C18, C8, C4, fenyl, cyano, amino, etc. Blant disse bundne funksjonelle gruppene er den mest brukte C18.Det er anslått at mer enn 80 % av RPC nå bruker C18 bundet fase.Derfor har C18-kromatografikolonne blitt en må-ha universalkolonne for hvert laboratorium.
Selv om C18-kolonne kan brukes i et veldig bredt spekter av applikasjoner, kan imidlertid vanlige C18-kolonner for noen prøver som er veldig polare eller svært hydrofile, ha problemer når de brukes til å rense slike prøver.I RPC kan de vanlige elueringsløsningsmidlene bestilles i henhold til deres polaritet: vann < metanol < acetonitril < etanol < tetrahydrofuran < isopropanol.For å sikre god retensjon på kolonnen for disse prøvene (sterke polare eller svært hydrofile), er det nødvendig med høy andel av vandig system som den mobile fasen.Men når man bruker rent vannsystem (inkludert rent vann eller ren saltløsning) som den mobile fasen, har den lange karbonkjeden på den stasjonære fasen av C18-kolonnen en tendens til å unngå vannet og blande seg med hverandre, noe som resulterer i en øyeblikkelig reduksjon i retensjonskapasitet til kolonnen eller til og med ingen retensjon.Dette fenomenet kalles "hydrofob fasekollaps" (som vist i venstre del av figur 1).Selv om denne situasjonen er reversibel når kolonnen vaskes med organiske løsningsmidler som metanol eller acetonitril, kan den fortsatt forårsake skade på kolonnen.Derfor er det nødvendig å forhindre at denne situasjonen oppstår.
Figur 1. Skjematisk diagram av de bundne fasene på overflaten av silikagel i vanlig C18-kolonne (venstre) og C18AQ-kolonne (høyre).
For å løse de ovennevnte problemene har produsentene av kromatografiske pakkematerialer gjort tekniske forbedringer.En av disse forbedringene er å gjøre noen modifikasjoner på overflaten av silikamatrisen, for eksempel innføring av hydrofile cyanogrupper (som vist i høyre del av figur 1), for å gjøre overflaten av silikagelen mer hydrofil.Dermed kunne C18-kjedene på silikaoverflaten forlenges fullstendig under svært vandige forhold og den hydrofobe fasekollapsen kunne unngås.Disse modifiserte C18 kolonnene kalles vandige C18 kolonner, nemlig C18AQ kolonner, som er designet for svært vandige elueringsforhold og tåler 100 % vandig system.C18AQ-kolonner har blitt mye brukt i separasjon og rensing av sterke polare forbindelser, inkludert organiske syrer, peptider, nukleosider og vannløselige vitaminer.
Avsalting er en av de typiske bruksområdene for C18AQ-kolonner i flashrensingen for prøver, som fjerner salt- eller bufferkomponentene i prøveløsningsmidlet for å lette påføringen av prøven i påfølgende studier.I dette innlegget ble Brilliant Blue FCF med sterk polaritet brukt som prøve og renset på C18AQ-kolonnen.Prøveløsningsmidlet ble erstattet med organisk løsningsmiddel fra bufferløsning, noe som letter den påfølgende rotasjonsfordampningen samt sparer løsningsmidler og driftstid.Videre ble renheten til prøven forbedret ved å fjerne noen urenheter i prøven.
eksperimentell del
Figur 2. Den kjemiske strukturen til prøven.
Brilliant Blue FCF ble brukt som prøve i dette innlegget.Renheten til råprøven var 86 % og den kjemiske strukturen til prøven ble vist i figur 2. For å klargjøre prøveløsningen ble 300 mg pulveraktig råstoff av Brilliant Blue FCF oppløst i 1 M NaH2PO4 bufferløsning og ristet godt for å bli en helt klar løsning.Prøveløsningen ble deretter injisert i flash-kolonnen med en injektor.Det eksperimentelle oppsettet av flash-rensingen er oppført i tabell 1.
| Instrument | SepaBean™-maskin2 | |||
| Patroner | 12 g SepaFlash C18 RP flash-patron (sfærisk silika, 20 - 45 μm, 100 Å, bestillingsnummer: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP-blitskassett (sfærisk silika, 20 - 45 μm, 100 Å, bestillingsnummer：SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Bølgelengde | 254 nm | |||
| Mobil fase | Løsemiddel A: Vann Løsemiddel B: Metanol | |||
| Strømningshastighet | 30 ml/min | |||
| Prøvelasting | 300 mg (Brilliant Blue FCF med en renhet på 86%) | |||
| Gradient | Tid (CV) | Løsemiddel B (%) | Tid (CV) | Løsemiddel B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultater og diskusjon
En SepaFlash C18AQ RP flash-patron ble brukt til prøveavsalting og rensing.Det ble benyttet trinngradient hvor rent vann ble brukt som mobil fase ved starten av elueringen og kjørt for 10 kolonnevolum (CV).Som vist i figur 3, ved bruk av rent vann som mobil fase, ble prøven holdt helt tilbake på flash-patronen.Deretter ble metanolen i mobilfasen økt direkte til 100 % og gradienten ble opprettholdt for 7,5 CV.Prøven ble eluert ut fra 11,5 til 13,5 CV.I de oppsamlede fraksjonene ble prøveløsningen erstattet fra NaH2PO4 bufferløsning til metanol.Sammenlignet med svært vandig løsning, var metanol mye lettere å fjerne ved rotasjonsfordampning i det påfølgende trinnet, noe som letter følgende forskning.
Figur 3. Flashkromatogrammet til prøven på en C18AQ patron.
For å sammenligne retensjonsadferden til C18AQ-kassetten og vanlig C18-kassett for prøver med sterk polaritet, ble parallell sammenligningstest utført.En SepaFlash C18 RP flash-kassett ble brukt og flash-kromatogrammet for prøven ble vist i figur 4. For vanlige C18-kassetter er det høyeste tolererte vannfaseforholdet ca. 90 %.Derfor ble startgradienten satt til 10 % metanol i 90 % vann.Som vist i figur 4, på grunn av den hydrofobe fasekollapsen av C18-kjedene forårsaket av høyt vannforhold, ble prøven knapt holdt tilbake på den vanlige C18-patronen og ble direkte eluert ut av den mobile fasen.Som et resultat kan operasjonen med prøveavsalting eller rensing ikke fullføres.
Figur 4. Flashkromatogrammet til prøven på en vanlig C18-patron.
Sammenlignet med lineær gradient har bruken av trinngradient følgende fordeler:
1. Løsemiddelbruk og kjøretid for prøverensing reduseres.
2. Målproduktet eluerer i en skarp topp, noe som reduserer volumet av oppsamlede fraksjoner og dermed letter den påfølgende rotasjonsfordampningen samt sparer tid.
3. Det oppsamlede produktet er i metanol som er lett å fordampe, dermed reduseres tørketiden.
Avslutningsvis, for rensing av prøven som er sterkt polar eller svært hydrofil, kan SepaFlash C18AQ RP-blitskassetter kombinert med det preparative flash-kromatografisystemet SepaBean™ Machine tilby en rask og effektiv løsning.
Om SepaFlash Bonded Series C18 RP flash-kassetter
Det finnes en serie SepaFlash C18AQ RP-blitskassetter med forskjellige spesifikasjoner fra Santai Technology (som vist i tabell 2).
| Artikkelnummer | Kolonnestørrelse | Strømningshastighet (ml/min) | Maks. trykk (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
Tabell 2. SepaFlash C18AQ RP flash-kassetter.
Emballasjematerialer: Høyeffektiv sfærisk C18(AQ)-bundet silika, 20 - 45 μm, 100 Å.
logikk (som vist i tabell 2).
Innleggstid: 27. august 2018