Hongcheng Wang, Bo Xu
Søknad FoU -senter
Introduksjon
I henhold til de relative polaritetene i stasjonær fase og mobil fase, kan væskekromatografi deles inn i normalfasekromatografi (NPC) og reversert fasekromatografi (RPC). For RPC er polariteten i den mobile fasen sterkere enn den stasjonære fasen. RPC har blitt den mest brukte en i væskekromatografiseparasjonsmodus på grunn av sin høye effektivitet, gode oppløsning og klar retensjonsmekanisme. Derfor er RPC egnet for separasjon og rensing av forskjellige polare eller ikke-polare forbindelser, inkludert alkaloider, karbohydrater, fettsyrer, steroider, nukleinsyrer, aminosyrer, peptider, proteiner. Cyano, amino osv. Blant disse bundne funksjonelle gruppene er den mest brukte en C18. Det anslås at mer enn 80% av RPC nå bruker C18 -bundet fase. Derfor har C18 kromatografikolonne blitt en must-have universell kolonne for hvert laboratorium.
Selv om C18 -kolonnen kan brukes i et veldig bredt spekter av applikasjoner, kan imidlertid vanlige C18 -kolonner ha problemer når de brukes til å rense slike prøver for noen prøver som er veldig polare eller sterkt hydrofile. I RPC kan de ofte brukte elueringsoppløsningsmidlene bestilles i henhold til deres polaritet: vann <metanol <acetonitril <etanol <tetrahydrofuran <isopropanol. For å sikre god oppbevaring på kolonnen for disse prøvene (sterk polar eller sterkt hydrofil), er det nødvendig med høy andel av vandig system for å brukes som mobilfase. Når du bruker rent vannsystem (inkludert rent vann eller ren saltløsning) som mobilfase, har den lange karbonkjeden imidlertid på den stasjonære fasen av C18 -kolonnen en tendens til å unngå vannet og blandes med hverandre, noe som resulterer i en øyeblikkelig reduksjon i retensjonskapasiteten til kolonnen eller til og med ingen retensjon. Dette fenomenet kalles "hydrofob fase kollaps" (som vist i venstre del av figur 1). Selv om denne situasjonen er reversibel når kolonnen vaskes med organiske løsningsmidler som metanol eller acetonitril, kan den fremdeles forårsake skade på kolonnen. Derfor er det nødvendig å forhindre at denne situasjonen skjer.
Figur 1. Det skjematiske diagrammet over de bundne fasene på overflaten av silikagel i vanlig C18 -kolonne (venstre) og C18aq -kolonnen (til høyre).
For å løse de ovennevnte problemene, har de kromatografiske pakkematerialprodusentene gjort tekniske forbedringer. En av disse forbedringene er å gjøre noen modifikasjoner på overflaten av silikamatrisen, for eksempel innføring av hydrofile cyanogrupper (som vist i høyre del av figur 1), for å gjøre overflaten til silikagelen mer hydrofil. Således kunne C18 -kjedene på silikaoverflaten forlenges helt under svært vandige forhold, og den hydrofobe fases kollaps kunne unngås. Disse modifiserte C18 -kolonnene kalles vandige C18 -kolonner, nemlig C18AQ -kolonner, som er designet for svært vandige elueringsbetingelser og tåler 100% vandig system. C18AQ-kolonner har blitt mye brukt i separasjon og rensing av sterke polare forbindelser, inkludert organiske syrer, peptider, nukleosider og vannløselige vitaminer.
Desalting er en av de typiske anvendelsene av C18AQ -kolonnene i blitzrensing for prøver, som fjerner salt- eller bufferkomponentene i prøven løsningsmiddel for å lette anvendelsen av prøven i påfølgende studier. I dette innlegget ble den strålende blå FCF med sterk polaritet brukt som prøve og renset på C18aq -kolonnen. Prøvens løsningsmiddel ble erstattet av organisk løsningsmiddel fra bufferløsning, og letter dermed følgende rotasjonsfordamping samt lagring av løsningsmidler og driftstid. Videre ble renheten til prøven forbedret ved å fjerne noen urenheter i prøven.
Eksperimentell seksjon
Figur 2.. Den kjemiske strukturen til prøven.
Den strålende blå FCF ble brukt som prøve i dette innlegget. Renheten til råprøven var 86% og den kjemiske strukturen til prøven ble vist i figur 2. For å fremstille prøveløsningen ble 300 mg pulveraktig rå faste stoff av strålende blå FCF oppløst i 1 m NAH2PO4 -bufferløsning og ristet godt til å bli en helt klar løsning. Prøveløsningen ble deretter injisert i flash -kolonnen med en injektor. Det eksperimentelle oppsettet av flash -rensing er oppført i tabell 1.
| Instrument | Sepabean ™ -maskin2 | |||
| Patroner | 12 g Sepaflash C18 RP Flash-kassett (sfærisk silika, 20-45 μm, 100 Å, ordrenummer: SW-5222-012-SP) | 12 G Sepaflash C18aq RP Flash-kassett (sfærisk silika, 20-45 μm, 100 Å, ordre nummer ： SW-5222-012-SP (aq)） | ||
| Bølgelengde | 254 nm | |||
| Mobil fase | Løsningsmiddel A ： Vann Løsningsmiddel B ： Metanol | |||
| Strømningshastighet | 30 ml/min | |||
| Eksempelbelastning | 300 mg (strålende blå FCF med renheten på 86%) | |||
| Gradient | Tid (CV) | Løsningsmiddel B (%) | Tid (CV) | Løsningsmiddel B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultater og diskusjon
En sepaflash C18aq RP Flash -kassett ble brukt til avsalting og rensing av prøve. Trinngradient ble benyttet der rent vann ble brukt som mobilfase i starten av eluering og kjørt for 10 kolonnevolum (CV). Som vist i figur 3, ble prøven ved bruk av rent vann som mobilfase, fullstendig beholdt på flash -kassetten. Deretter ble metanolen i mobilfasen direkte økt til 100% og gradienten ble opprettholdt for 7,5 CV. Prøven ble eluert fra 11,5 til 13,5 CV. I de innsamlede fraksjonene ble prøveløsningen erstattet fra NAH2PO4 -bufferløsningen til metanol. Sammenlignet med svært vandig løsning var metanol mye lettere å bli fjernet ved rotasjonsfordamping i det påfølgende trinnet, noe som letter følgende forskning.
Figur 3. Blitskromatogrammet av prøven på en C18aq -kassett.
For å sammenligne retensjonsatferden til C18aq -kassett og vanlig C18 -kassett for prøver av sterk polaritet, ble parallell sammenligningstest utført. En sepaflash C18 RP -flash -kassett ble brukt og blitzkromatogrammet for prøven ble vist i figur 4. For vanlige C18 -kassetter er det høyeste tolererte vandige faseforholdet omtrent 90%. Derfor ble startgradienten satt til 10% metanol i 90% vann. Som vist i figur 4, på grunn av den hydrofobe fases kollaps av C18 -kjedene forårsaket av høyt vandig forhold, ble prøven knapt beholdt på den vanlige C18 -kassetten og ble direkte eluert av den mobile fasen. Som et resultat kan ikke driften av prøveavsalting eller rensing fullføres.
Figur 4. Flash -kromatogrammet av prøven på en vanlig C18 -kassett.
Sammenlignet med lineær gradient, har bruken av trinngradient følgende fordeler:
1. Løsningsmiddelbruk og kjøretid for prøvens rensing reduseres.
2. Målproduktet eluerer i en skarp topp, noe som reduserer volumet av innsamlede brøk og dermed letter følgende rotasjonsfordamping samt sparetid.
3. Det innsamlede produktet er i metanol som er lett å bli fordampet, og dermed reduseres tørketiden.
Avslutningsvis, for rensing av prøven som er sterkt polar eller sterkt hydrofil, kan sepaflash C18aq RP Flash -kassetter som kombineres med den forberedende flashkromatografisystemet Sepabean ™ -maskin tilby en rask og effektiv løsning.
Om Sepaflash Bonded Series C18 RP Flash -kassetter
Det er en serie av Sepaflash C18aq RP Flash -kassetter med forskjellige spesifikasjoner fra Santai -teknologien (som vist i tabell 2).
| Varenummer | Kolonnestørrelse | Strømningshastighet (ml/min) | Max.Pressure (Psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabell 2. Sepaflash C18AQ RP Flash -kassetter.
Pakkematerialer: Sfærisk C18 (aq) -bundet silika, 20-45 μm, 100 Å.
logy (som vist i tabell 2).
Post Time: Aug-27-2018