Hongcheng Wang, Bo Xu
Applikazzjoni R&D Ċentru
Introduzzjoni
Skont il-polaritajiet relattivi tal-fażi stazzjonarja u l-fażi mobbli, il-kromatografija likwida tista 'tinqasam f'kromatografija ta' fażi normali (NPC) u kromatografija ta 'fażi maqluba (RPC).Għal RPC, il-polarità tal-fażi mobbli hija aktar b'saħħitha minn dik tal-fażi stazzjonarja.RPC sar l-aktar wieħed użat fil-modi ta 'separazzjoni tal-kromatografija likwida minħabba l-effiċjenza għolja tiegħu, ir-riżoluzzjoni tajba u l-mekkaniżmu ta' żamma ċara.Għalhekk RPC huwa adattat għas-separazzjoni u l-purifikazzjoni ta 'diversi komposti polari jew mhux polari, inklużi alkalojdi, karboidrati, aċidi grassi, sterojdi, aċidi nuklejċi, aċidi amminiċi, peptidi, proteini, eċċ F'RPC, il-fażi stazzjonarja l-aktar użata komunement hija il-matriċi tal-ġel tas-silika li hija marbuta ma 'diversi gruppi funzjonali, inklużi C18, C8, C4, phenyl, cyano, amino, eċċ Fost dawn il-gruppi funzjonali marbuta, l-aktar wieħed użat huwa C18.Huwa stmat li aktar minn 80% ta 'RPC issa qed jużaw fażi magħquda C18.Għalhekk il-kolonna tal-kromatografija C18 saret kolonna universali indispensabbli għal kull laboratorju.
Għalkemm il-kolonna C18 tista 'tintuża f'firxa wiesgħa ħafna ta' applikazzjonijiet, madankollu, għal xi kampjuni li huma polari ħafna jew idrofiliċi ħafna, kolonni C18 regolari jista 'jkollhom problemi meta jintużaw biex jippurifikaw kampjuni bħal dawn.F'RPC, is-solventi ta 'eluzzjoni użati komunement jistgħu jiġu ordnati skond il-polarità tagħhom: ilma < metanol < aċetonitrile < etanol < tetrahydrofuran < isopropanol.Biex tkun żgurata żamma tajba fuq il-kolonna għal dawn il-kampjuni (polari qawwija jew idrofili ħafna), proporzjon għoli ta 'sistema milwiema huwa meħtieġ li jintuża bħala l-fażi mobbli.Madankollu, meta tuża sistema ta 'ilma pur (inkluż ilma pur jew soluzzjoni ta' melħ pur) bħala l-fażi mobbli, il-katina twila tal-karbonju fuq il-fażi stazzjonarja tal-kolonna C18 għandha tendenza li tevita l-ilma u tħallat ma 'xulxin, li tirriżulta fi tnaqqis istantanju fil- kapaċità ta 'żamma tal-kolonna jew saħansitra l-ebda żamma.Dan il-fenomenu jissejjaħ "kollass tal-fażi idrofobika" (kif muri fil-parti tax-xellug tal-Figura 1).Għalkemm din is-sitwazzjoni hija riversibbli meta l-kolonna tinħasel b'solventi organiċi bħal metanol jew aċetonitrile, xorta tista 'tikkawża ħsara lill-kolonna.Għalhekk, huwa meħtieġ li tiġi evitata din is-sitwazzjoni milli sseħħ.
Figura 1. Id-dijagramma skematika tal-fażijiet magħqudin fuq il-wiċċ tal-ġel tas-silika f'kolonna regolari C18 (xellug) u kolonna C18AQ (lemin).
Biex jindirizzaw il-problemi msemmija hawn fuq, il-manifatturi tal-materjali tal-ippakkjar kromatografiċi għamlu titjib tekniku.Wieħed minn dawn it-titjib qed jagħmel xi modifiki fuq il-wiċċ tal-matriċi tas-silika, bħall-introduzzjoni ta 'gruppi cyano idrofiliċi (kif muri fil-parti tal-lemin tal-Figura 1), biex il-wiċċ tal-ġel tas-silika jsir aktar idrofiliku.Għalhekk il-ktajjen C18 fuq il-wiċċ tas-silika jistgħu jiġu estiżi għal kollox taħt kundizzjonijiet ta 'ilma ħafna u l-kollass tal-fażi idrofobika jista' jiġi evitat.Dawn il-kolonni C18 modifikati jissejħu kolonni C18 milwiema, jiġifieri kolonni C18AQ, li huma ddisinjati għal kundizzjonijiet ta 'eluzzjoni milwiema ħafna u jistgħu jittolleraw sistema milwiema ta' 100%.Kolonni C18AQ ġew applikati b'mod wiesa 'fis-separazzjoni u l-purifikazzjoni ta' komposti polari b'saħħithom, inklużi aċidi organiċi, peptidi, nukleosidi u vitamini li jinħallu fl-ilma.
It-tneħħija tal-melħ hija waħda mill-applikazzjonijiet tipiċi tal-kolonni C18AQ fil-purifikazzjoni flash għall-kampjuni, li tneħħi l-komponenti tal-melħ jew tal-buffer fis-solvent tal-kampjun biex tiffaċilita l-applikazzjoni tal-kampjun fi studji sussegwenti.F'din il-kariga, intuża l-Blue Brilliant FCF b'polarità qawwija bħala l-kampjun u ppurifikat fuq il-kolonna C18AQ.Is-solvent tal-kampjun ġie sostitwit b'solvent organiku minn soluzzjoni buffer, u b'hekk iffaċilita l-evaporazzjoni rotatorja li ġejja kif ukoll issalva solventi u ħin operattiv.Barra minn hekk, il-purità tal-kampjun ġiet imtejba billi tneħħew xi impuritajiet fil-kampjun.
Taqsima Sperimentali
Figura 2. L-istruttura kimika tal-kampjun.
Il-Blue Brilliant FCF intuża bħala l-kampjun f'din il-kariga.Il-purità tal-kampjun mhux ipproċessat kienet ta '86% u l-istruttura kimika tal-kampjun kienet murija fil-Figura 2. Biex tipprepara s-soluzzjoni tal-kampjun, 300 mg solidu trab mhux raffinat ta' Brilliant Blue FCF ġie maħlul f'soluzzjoni buffer NaH2PO4 1 M u ħawwad sew biex isir soluzzjoni kompletament ċara.Is-soluzzjoni tal-kampjun imbagħad ġiet injettata fil-kolonna flash b'injettur.Is-setup sperimentali tal-purifikazzjoni flash hija elenkata fit-Tabella 1.
| Strument | Magni SepaBean™2 | |||
| Skrataċ | Skartoċċ flash SepaFlash C18 RP 12 g (silika sferika, 20 - 45 μm, 100 Å, Numru tal-ordni: SW-5222-012-SP) | Skartoċċ flash SepaFlash C18AQ RP 12 g (silika sferika, 20 - 45 μm, 100 Å, Numru tal-ordni: SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Tul tal-mewġ | 254 nm | |||
| Fażi mobbli | Solvent A: Ilma Solvent B: metanol | |||
| Rata tal-fluss | 30 mL/min | |||
| Tagħbija tal-kampjun | 300 mg (Brilliant Blue FCF bil-purità ta '86%) | |||
| Gradjent | Ħin (CV) | Solvent B (%) | Ħin (CV) | Solvent B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Riżultati u diskussjoni
Intuża skartoċċ flash SepaFlash C18AQ RP għat-tneħħija tal-melħ u l-purifikazzjoni tal-kampjun.Ġie utilizzat gradjent tal-pass li fih intuża ilma pur bħala l-fażi mobbli fil-bidu tal-elużjoni u mmexxi għal 10 volumi ta 'kolonna (CV).Kif muri fil-Figura 3, meta jintuża ilma pur bħala l-fażi mobbli, il-kampjun inżamm kompletament fuq l-iskartoċċ tal-flash.Sussegwentement, il-metanol fil-fażi mobbli żdied direttament għal 100% u l-gradjent inżamm għal 7.5 CV.Il-kampjun ġie eluwit minn 11.5 sa 13.5 CV.Fil-frazzjonijiet miġbura, is-soluzzjoni tal-kampjun ġiet sostitwita minn soluzzjoni buffer NaH2PO4 għal metanol.Meta mqabbel ma 'soluzzjoni milwiema ħafna, il-metanol kien ħafna aktar faċli biex jitneħħa permezz ta' evaporazzjoni li ddur fil-pass sussegwenti, li jiffaċilita r-riċerka li ġejja.
Figura 3. Il-flash chromatogram tal-kampjun fuq skartoċċ C18AQ.
Biex titqabbel l-imġiba ta 'żamma ta' skartoċċ C18AQ u skartoċċ C18 regolari għal kampjuni ta 'polarità qawwija, sar test ta' tqabbil parallel.Intuża skrataċ flash SepaFlash C18 RP u l-kromatogramma flash għall-kampjun intweriet fil-Figura 4. Għal skrataċ C18 regolari, l-ogħla proporzjon tal-fażi milwiema tollerat huwa madwar 90%.Għalhekk il-gradjent tal-bidu ġie stabbilit għal 10% metanol f'90% ilma.Kif muri fil-Figura 4, minħabba l-kollass tal-fażi idrofobika tal-ktajjen C18 ikkawżat minn proporzjon għoli ta 'l-ilma, il-kampjun bilkemm inżamm fuq l-iskartoċċ C18 regolari u ġie eluwit direttament mill-fażi mobbli.Bħala riżultat, l-operazzjoni tat-tneħħija tal-melħ jew il-purifikazzjoni tal-kampjun ma tistax titlesta.
Figura 4. Il-kromatogramma flash tal-kampjun fuq skartoċċ C18 regolari.
Meta tqabbel mal-gradjent lineari, l-użu tal-gradjent tal-pass għandu l-vantaġġi li ġejjin:
1. L-użu tas-solvent u l-ħin tat-tħaddim għall-purifikazzjoni tal-kampjun jitnaqqas.
2. Il-prodott immirat joħroġ f'quċċata qawwija, li tnaqqas il-volum tal-frazzjonijiet miġbura u b'hekk tiffaċilita l-evaporazzjoni rotatorja li ġejja kif ukoll tiffranka l-ħin.
3. Il-prodott miġbur huwa fil-metanol li huwa faċli biex jiġi evaporat, u b'hekk il-ħin tat-tnixxif jitnaqqas.
Bħala konklużjoni, għall-purifikazzjoni tal-kampjun li huwa polari qawwi jew idrofiliku ħafna, l-iskrataċ flash SepaFlash C18AQ RP li jikkombinaw mas-sistema preparattiva tal-kromatografija flash SepaBean™ Machine jistgħu joffru soluzzjoni veloċi u effiċjenti.
Dwar is-SepaFlash Bonded Series C18 RP flash cartridges
Hemm serje ta 'skrataċ flash SepaFlash C18AQ RP bi speċifikazzjonijiet differenti minn Santai Technology (kif muri fit-Tabella 2).
| Numru tal-Oġġett | Daqs tal-Kolonna | Rata tal-Fluss (mL/min) | Max.Pressjoni (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabella 2. Skrataċ flash SepaFlash C18AQ RP.
Materjali tal-ippakkjar: Silika sferika ta 'effiċjenza għolja C18(AQ)-bonded, 20 - 45 μm, 100 Å.
(kif muri fit-Tabella 2).
Ħin tal-post: Awissu-27-2018