Hongcheng Wang, Bo Xu
Ċentru tal-Applikazzjoni R&D
Introduzzjoni
Skond il-polaritajiet relattivi tal-fażi wieqfa u l-fażi mobbli, il-kromatografija likwida tista 'tinqasam fi kromatografija ta' fażi normali (NPC) u kromatografija tal-fażi maqluba (RPC). Għall-RPC, il-polarità tal-fażi mobbli hija aktar b'saħħitha minn dik tal-fażi wieqfa. L-RPC saret l-iktar waħda użata fil-modi ta 'separazzjoni tal-kromatografija likwida minħabba l-effiċjenza għolja tagħha, riżoluzzjoni tajba u mekkaniżmu ta' żamma ċara. Għalhekk l-RPC huwa adattat għas-separazzjoni u l-purifikazzjoni ta 'diversi komposti polari jew mhux polari, inklużi alkalojdi, karboidrati, aċidi grassi, sterojdi, aċidi nuklejiċi, aċidi amminiċi, peptidi, proteini, eċċ f'RPC, il-fażi stazzjonarja l-iktar użata hija l-matriċi tal-ġel tas-silika li hija marbuta ma' gruppi funzjonali varji, inkluż C18, C8, C4, Phenyl Cyano, Amino, eċċ Fost dawn il-gruppi funzjonali marbuta, l-iktar wieħed użat huwa C18. Huwa stmat li aktar minn 80% tal-RPC issa qed jużaw fażi marbuta C18. Għalhekk il-kolonna tal-kromatografija C18 saret kolonna universali indispensabbli għal kull laboratorju.
Għalkemm il-kolonna C18 tista 'tintuża f'firxa wiesgħa ħafna ta' applikazzjonijiet, madankollu, għal xi kampjuni li huma polari ħafna jew idrofiliċi ħafna, kolonni regolari C18 jista 'jkollhom problemi meta jintużaw biex jippurifikaw dawn il-kampjuni. Fl-RPC, is-solventi ta 'elużjoni użati b'mod komuni jistgħu jiġu ordnati skond il-polarità tagħhom: l-ilma <metanol <acetonitrile <etanol <tetrahydrofuran <isopropanol. Biex tassigura żamma tajba fuq il-kolonna għal dawn il-kampjuni (polari b'saħħithom jew idrofiliċi ħafna), proporzjon għoli ta 'sistema milwiema huwa meħtieġ biex jintuża bħala l-fażi mobbli. Madankollu, meta tuża sistema ta 'ilma pur (inkluża ilma pur jew soluzzjoni tal-melħ pur) bħala l-fażi mobbli, il-katina tal-karbonju twila fuq il-fażi wieqfa tal-kolonna C18 għandha tendenza li tevita l-ilma u tħallat ma' xulxin, li tirriżulta fi tnaqqis istantanju fil-kapaċità ta 'żamma tal-kolonna jew anke mingħajr żamma. Dan il-fenomenu jissejjaħ “kollass tal-fażi idrofobika” (kif muri fil-parti tax-xellug tal-Figura 1). Għalkemm din is-sitwazzjoni hija riversibbli meta l-kolonna tinħasel b'solventi organiċi bħal metanol jew acetonitrile, xorta tista 'tikkawża ħsara lill-kolonna. Għalhekk, huwa meħtieġ li din is-sitwazzjoni tiġi evitata.
Figura 1. Id-dijagramma skematika tal-fażijiet marbuta fuq il-wiċċ tal-ġel tas-silika f'kolonna C18 regolari (xellug) u kolonna C18AQ (lemin).
Biex jindirizzaw il-problemi msemmija hawn fuq, il-manifatturi tal-materjali tal-ippakkjar kromatografiċi għamlu titjib tekniku. Wieħed minn dawn it-titjib huwa li tagħmel xi modifiki fuq il-wiċċ tal-matriċi tas-silika, bħall-introduzzjoni ta 'gruppi ta' cyano idrofiliċi (kif muri fil-parti tal-lemin tal-Figura 1), biex tagħmel il-wiċċ tal-ġel tas-silika aktar idrofiliku. Għalhekk il-ktajjen C18 fuq il-wiċċ tas-silika jistgħu jiġu estiżi għal kollox f'kundizzjonijiet milwiema ħafna u l-kollass tal-fażi idrofobika jista 'jiġi evitat. Dawn il-kolonni C18 modifikati jissejħu kolonni ta 'l-ilma C18, jiġifieri kolonni C18AQ, li huma ddisinjati għal kundizzjonijiet ta' elużjoni milwiema ħafna u jistgħu jittolleraw sistema ta '100% milwiema. Il-kolonni C18AQ ġew applikati b'mod wiesa 'fis-separazzjoni u l-purifikazzjoni ta' komposti polari qawwija, inklużi aċidi organiċi, peptidi, nukleosidi u vitamini li jinħallu fl-ilma.
Id-desalting hija waħda mill-applikazzjonijiet tipiċi tal-kolonni C18AQ fil-purifikazzjoni tal-flash għal kampjuni, li tneħħi l-komponenti tal-melħ jew buffer fis-solvent tal-kampjun biex tiffaċilita l-applikazzjoni tal-kampjun fi studji sussegwenti. F'din il-kariga, l-FCF blu brillanti b'polarità qawwija ntuża bħala l-kampjun u ppurifikat fuq il-kolonna C18AQ. Is-solvent tal-kampjun ġie sostitwit b'solvent organiku mis-soluzzjoni buffer, u b'hekk iffaċilita l-evaporazzjoni li ddur li ġej kif ukoll iffrankar ta 'solventi u ħin ta' tħaddim. Barra minn hekk, il-purità tal-kampjun ġiet imtejba billi jitneħħew xi impuritajiet fil-kampjun.
Sezzjoni sperimentali
Figura 2. L-istruttura kimika tal-kampjun.
L-FCF blu brillanti ntuża bħala l-kampjun f'din il-kariga. Il-purità tal-kampjun mhux maħdum kienet ta '86% u l-istruttura kimika tal-kampjun ġiet murija fil-Figura 2 Is-soluzzjoni tal-kampjun imbagħad ġiet injettata fil-kolonna tal-flash minn injettur. Is-setup sperimentali tal-purifikazzjoni tal-flash huwa elenkat fit-Tabella 1.
| Strument | Magna Sepabean ™2 | |||
| Skartoċċi | 12 g SEPAFLASH C18 RP Flash Cartridge (silika sferika, 20 - 45 μm, 100 Å, Numru tal-Ordni: SW-5222-012-SP) | 12 g Sepaflash C18AQ RP Flash Cartridge (silika sferika, 20 - 45 μm, 100 Å, numru tal-ordni ： SW-5222-012-SP (aq (aq (aq (aq)） | ||
| Tul tal-mewġa | 254 nm | |||
| Fażi mobbli | Solvent ： ilma Solvent B ： Metanol | |||
| Rata tal-fluss | 30 ml / min | |||
| Tagħbija tal-kampjun | 300 mg (FCF blu brillanti bil-purità ta '86%) | |||
| Gradjent | Ħin (CV) | Solvent B (%) | Ħin (CV) | Solvent B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Riżultati u diskussjoni
Skartoċċ flash SEPAFLASH C18AQ RP intuża għall-kampjun u l-purifikazzjoni tal-kampjun. Ġie użat gradjent tal-pass li fih intuża ilma pur bħala l-fażi mobbli fil-bidu tal-elużjoni u mmexxi għal 10 volumi tal-kolonni (CV). Kif muri fil-Figura 3, meta jintuża ilma pur bħala l-fażi mobbli, il-kampjun inżamm kompletament fuq l-iskartoċċ tal-flash. Sussegwentement, il-metanol fil-fażi mobbli żdied direttament għal 100% u l-gradjent inżamm għal 7.5 cv. Il-kampjun ġie elwit minn 11.5 sa 13.5 cv. Fil-frazzjonijiet miġbura, is-soluzzjoni tal-kampjun ġiet sostitwita mis-soluzzjoni buffer Nah2PO4 għal metanol. Meta mqabbel ma 'soluzzjoni milwiema ħafna, il-metanol kien ħafna iktar faċli biex jitneħħa permezz ta' evaporazzjoni li jdur fil-pass sussegwenti, li jiffaċilita r-riċerka li ġejja.
Figura 3. Il-kromatogramma flash tal-kampjun fuq skartoċċ C18AQ.
Biex tqabbel l-imġieba taż-żamma ta 'skartoċċ C18AQ u skartoċċ regolari C18 għal kampjuni ta' polarità qawwija, sar test parallel ta 'paragun. Intuża skartoċċ flash SEPAFLASH C18 RP u l-kromatogramma flash għall-kampjun ġiet murija fil-Figura 4. Għal skrataċ regolari C18, l-ogħla proporzjon ta 'fażi ta' l-ilma tollerat huwa ta 'madwar 90%. Għalhekk il-gradjent tal-bidu ġie stabbilit għal 10% metanol f'90% ilma. Kif muri fil-Figura 4, minħabba l-kollass tal-fażi idrofobika tal-ktajjen C18 ikkawżati minn proporzjon ta 'l-ilma għoli, il-kampjun bilkemm inżamm fuq l-iskartoċċ C18 regolari u ġie eluż direttament mill-fażi mobbli. Bħala riżultat, it-tħaddim ta 'desalting jew purifikazzjoni tal-kampjun ma jistax jitlesta.
Figura 4. Il-kromatogramma flash tal-kampjun fuq skartoċċ regolari C18.
Meta mqabbel ma 'gradjent lineari, l-użu tal-gradjent tal-pass għandu l-vantaġġi li ġejjin:
1. L-użu tas-solvent u l-ħin tal-ġirja għall-purifikazzjoni tal-kampjun jitnaqqas.
2. Il-prodott fil-mira joħroġ fil-quċċata qawwija, li jnaqqas il-volum ta 'frazzjonijiet miġbura u b'hekk jiffaċilita l-evaporazzjoni li jdur li ġej kif ukoll jiffranka l-ħin.
3
Bħala konklużjoni, għall-purifikazzjoni tal-kampjun li huwa ferm polari jew idrofiliċi ħafna, sepaflash C18AQ RP flash cartridges li jikkombinaw mas-sistema tal-kromatografija flash preparattiva sepabean ™ magna tista 'toffri soluzzjoni mgħaġġla u effiċjenti.
Dwar is-Serje Bondjata tas-Sepaflash C18 RP Flash Cartridges
Hemm serje ta 'skartoċċi tal-flash Sepaflash C18AQ RP bi speċifikazzjonijiet differenti mit-teknoloġija Santai (kif muri fit-Tabella 2).
| Numru tal-oġġett | Daqs tal-kolonna | Rata tal-fluss (ml / min) | Max.Pressure (psi / bar) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5.4 g | 5-15 | 400 / 27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400 / 27.5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400 / 27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400 / 27.5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350 / 24.0 |
| SW-5222-120-SP (aq) | 155 g | 30-60 | 300 / 20.7 |
| SW-52222-220-SP (aq) | 300 g | 40-80 | 300 / 20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250 / 17.2 |
Tabella 2. Sepaflash C18AQ RP Flash Cartridges.
Materjali tal-ippakkjar: silika sferika ta 'effiċjenza għolja C18 (aq), 20 - 45 μm, 100 Å.
Logy (kif muri fit-Tabella 2).
Ħin ta 'wara: 27 ta' Awwissu-2018