Hongcheng Wang, Bo Xu
Pusat R&D Aplikasi
pengenalan
Mengikut kekutuban relatif fasa pegun dan fasa bergerak, kromatografi cecair boleh dibahagikan kepada kromatografi fasa normal (NPC) dan kromatografi fasa terbalik (RPC).Untuk RPC, kekutuban fasa mudah alih adalah lebih kuat daripada fasa pegun.RPC telah menjadi yang paling banyak digunakan dalam mod pengasingan kromatografi cecair kerana kecekapannya yang tinggi, resolusi yang baik dan mekanisme pengekalan yang jelas.Oleh itu RPC sesuai untuk pengasingan dan penulenan pelbagai sebatian polar atau bukan kutub, termasuk alkaloid, karbohidrat, asid lemak, steroid, asid nukleik, asid amino, peptida, protein, dll. Dalam RPC, fasa pegun yang paling biasa digunakan ialah matriks gel silika yang terikat dengan pelbagai kumpulan berfungsi, termasuk C18, C8, C4, fenil, cyano, amino, dll. Antara kumpulan berfungsi terikat ini, yang paling banyak digunakan ialah C18.Dianggarkan lebih daripada 80% RPC kini menggunakan fasa terikat C18.Oleh itu lajur kromatografi C18 telah menjadi lajur universal yang mesti ada bagi setiap makmal.
Walaupun lajur C18 boleh digunakan dalam julat aplikasi yang sangat luas, namun, bagi sesetengah sampel yang sangat kutub atau sangat hidrofilik, lajur C18 biasa mungkin menghadapi masalah apabila digunakan untuk membersihkan sampel tersebut.Dalam RPC, pelarut elusi yang biasa digunakan boleh dipesan mengikut kekutubannya: air < metanol < asetonitril < etanol < tetrahydrofuran < isopropanol.Untuk memastikan pengekalan yang baik pada lajur untuk sampel ini (kutub kuat atau sangat hidrofilik), bahagian sistem akueus yang tinggi perlu digunakan sebagai fasa bergerak.Walau bagaimanapun, apabila menggunakan sistem air tulen (termasuk air tulen atau larutan garam tulen) sebagai fasa bergerak, rantai karbon panjang pada fasa pegun lajur C18 cenderung untuk mengelakkan air dan bercampur antara satu sama lain, mengakibatkan penurunan serta-merta dalam kapasiti pengekalan lajur atau bahkan tiada pengekalan.Fenomena ini dipanggil "keruntuhan fasa hidrofobik" (seperti yang ditunjukkan di bahagian kiri Rajah 1).Walaupun keadaan ini boleh diterbalikkan apabila lajur dibasuh dengan pelarut organik seperti metanol atau asetonitril, ia masih boleh menyebabkan kerosakan pada lajur.Oleh itu, adalah perlu untuk mengelakkan keadaan ini daripada berlaku.
Rajah 1. Gambarajah skematik fasa terikat pada permukaan gel silika dalam lajur C18 biasa (kiri) dan lajur C18AQ (kanan).
Untuk menangani masalah yang disebutkan di atas, pengeluar bahan pembungkus kromatografi telah membuat penambahbaikan teknikal.Salah satu daripada penambahbaikan ini ialah membuat beberapa pengubahsuaian pada permukaan matriks silika, seperti pengenalan kumpulan siano hidrofilik (seperti yang ditunjukkan di bahagian kanan Rajah 1), untuk menjadikan permukaan gel silika lebih hidrofilik.Oleh itu rantaian C18 pada permukaan silika boleh dilanjutkan sepenuhnya dalam keadaan berair tinggi dan keruntuhan fasa hidrofobik dapat dielakkan.Lajur C18 yang diubah suai ini dipanggil lajur C18 akueus, iaitu lajur C18AQ, yang direka bentuk untuk keadaan elusi berair tinggi dan boleh bertolak ansur dengan sistem akueus 100%.Lajur C18AQ telah digunakan secara meluas dalam pengasingan dan penulenan sebatian polar yang kuat, termasuk asid organik, peptida, nukleosida dan vitamin larut air.
Penyahgaraman ialah salah satu aplikasi biasa lajur C18AQ dalam penulenan kilat untuk sampel, yang mengeluarkan garam atau komponen penimbal dalam pelarut sampel untuk memudahkan penggunaan sampel dalam kajian seterusnya.Dalam siaran ini, Brilliant Blue FCF dengan kekutuban yang kuat telah digunakan sebagai sampel dan disucikan pada lajur C18AQ.Pelarut sampel digantikan dengan pelarut organik daripada larutan penimbal, dengan itu memudahkan penyejatan berputar berikut serta menjimatkan pelarut dan masa operasi.Tambahan pula, ketulenan sampel telah dipertingkatkan dengan menyingkirkan beberapa kekotoran dalam sampel.
Bahagian Eksperimen
Rajah 2. Struktur kimia sampel.
Brilliant Blue FCF telah digunakan sebagai sampel dalam siaran ini.Ketulenan sampel mentah adalah 86% dan struktur kimia sampel ditunjukkan dalam Rajah 2. Untuk menyediakan larutan sampel, 300 mg serbuk pepejal mentah Brilliant Blue FCF telah dilarutkan dalam larutan penimbal 1 M NaH2PO4 dan digoncang dengan baik untuk menjadi penyelesaian yang jelas sepenuhnya.Larutan sampel kemudian disuntik ke dalam ruangan kilat oleh penyuntik.Persediaan eksperimen penulenan kilat disenaraikan dalam Jadual 1.
| Alat | Mesin SepaBean™2 | |||
| Kartrij | 12 g kartrij denyar SepaFlash C18 RP (silika sfera, 20 - 45 μm, 100 Å, Nombor pesanan: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP kartrij denyar (silika sfera, 20 - 45 μm, 100 Å, Nombor pesanan：SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Panjang gelombang | 254 nm | |||
| Fasa mudah alih | Pelarut A：Air Pelarut B：Methanol | |||
| Kadar aliran | 30 mL/min | |||
| Pemuatan sampel | 300 mg (Brilliant Blue FCF dengan ketulenan 86%) | |||
| Kecerunan | Masa (CV) | Pelarut B (%) | Masa (CV) | Pelarut B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Keputusan dan perbincangan
Kartrij denyar SepaFlash C18AQ RP telah digunakan untuk penyahgaraman dan penulenan sampel.Kecerunan langkah telah digunakan di mana air tulen digunakan sebagai fasa bergerak pada permulaan elusi dan dijalankan untuk 10 isipadu lajur (CV).Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, apabila menggunakan air tulen sebagai fasa bergerak, sampel telah disimpan sepenuhnya pada kartrij denyar.Seterusnya, metanol dalam fasa mudah alih terus meningkat kepada 100% dan kecerunan dikekalkan untuk 7.5 CV.Sampel telah dikeluarkan dari 11.5 hingga 13.5 CV.Dalam pecahan terkumpul, larutan sampel digantikan daripada larutan penimbal NaH2PO4 kepada metanol.Berbanding dengan larutan berair tinggi, metanol adalah lebih mudah untuk dikeluarkan melalui penyejatan berputar dalam langkah seterusnya, yang memudahkan penyelidikan berikut.
Rajah 3. Kromatogram kilat bagi sampel pada kartrij C18AQ.
Untuk membandingkan tingkah laku pengekalan kartrij C18AQ dan kartrij C18 biasa untuk sampel kekutuban kuat, ujian perbandingan selari telah dilakukan.Kartrij denyar SepaFlash C18 RP telah digunakan dan kromatogram denyar untuk sampel ditunjukkan dalam Rajah 4. Bagi kartrij C18 biasa, nisbah fasa akueus yang diterima paling tinggi ialah kira-kira 90%.Oleh itu kecerunan permulaan ditetapkan pada 10% metanol dalam 90% air.Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4, disebabkan oleh keruntuhan fasa hidrofobik rantai C18 yang disebabkan oleh nisbah akueus yang tinggi, sampel hampir tidak disimpan pada kartrij C18 biasa dan terus dicairkan oleh fasa mudah alih.Akibatnya, operasi penyahgaraman atau penulenan sampel tidak dapat diselesaikan.
Rajah 4. Kromatogram kilat sampel pada kartrij C18 biasa.
Berbanding dengan kecerunan linear, penggunaan kecerunan langkah mempunyai kelebihan berikut:
1. Penggunaan pelarut dan masa larian untuk penulenan sampel dikurangkan.
2. Produk sasaran meleleh dalam kemuncak yang tajam, yang mengurangkan isipadu pecahan terkumpul dan dengan itu memudahkan penyejatan berputar berikut serta menjimatkan masa.
3. Produk yang dikumpul adalah dalam metanol yang mudah disejat, oleh itu masa pengeringan dikurangkan.
Kesimpulannya, untuk penulenan sampel yang sangat kutub atau sangat hidrofilik, kartrij denyar SepaFlash C18AQ RP digabungkan dengan sistem kromatografi denyar persediaan Mesin SepaBean™ boleh menawarkan penyelesaian yang pantas dan cekap.
Mengenai kartrij denyar SepaFlash Bonded Series C18 RP
Terdapat satu siri kartrij denyar SepaFlash C18AQ RP dengan spesifikasi berbeza daripada Teknologi Santai (seperti ditunjukkan dalam Jadual 2).
| Nombor Item | Saiz Lajur | Kadar aliran (mL/min) | Tekanan Maks (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Jadual 2. Katrij denyar SepaFlash C18AQ RP.
Bahan pembungkusan: Silika terikat sfera C18(AQ) berkecekapan tinggi, 20 - 45 μm, 100 Å.
logi (seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 2).
Masa siaran: Ogos-27-2018