Hongcheng Wang, Bo Xu
Permohonan R & D Pusat
Pengenalan
Menurut polariti relatif fasa pegun dan fasa mudah alih, kromatografi cecair boleh dibahagikan kepada kromatografi fasa normal (NPC) dan kromatografi fasa terbalik (RPC). Bagi RPC, polariti fasa mudah alih lebih kuat daripada fasa pegun. RPC telah menjadi yang paling banyak digunakan dalam mod pemisahan kromatografi cecair kerana kecekapan yang tinggi, resolusi yang baik dan mekanisme pengekalan yang jelas. Oleh itu, RPC sesuai untuk pemisahan dan pemurnian pelbagai sebatian kutub atau bukan kutub, termasuk alkaloid, karbohidrat, asid lemak, steroid, asid nukleik, asid amino, peptida, protein, dan lain-lain. Cyano, Amino, dan lain -lain di antara kumpulan -kumpulan fungsional yang terikat, yang paling banyak digunakan ialah C18. Dianggarkan bahawa lebih daripada 80% RPC kini menggunakan fasa terikat C18. Oleh itu, lajur kromatografi C18 telah menjadi lajur sejagat yang mesti ada untuk setiap makmal.
Walaupun lajur C18 boleh digunakan dalam pelbagai aplikasi yang sangat luas, bagaimanapun, untuk beberapa sampel yang sangat kutub atau sangat hidrofilik, lajur C18 biasa mungkin mempunyai masalah apabila digunakan untuk membersihkan sampel tersebut. Dalam RPC, pelarut elusi yang biasa digunakan boleh dipesan mengikut polaritas mereka: air <metanol <acetonitrile <ethanol <tetrahydrofuran <isopropanol. Untuk memastikan pengekalan yang baik pada lajur untuk sampel ini (kutub kuat atau sangat hidrofilik), bahagian sistem berair yang tinggi diperlukan untuk digunakan sebagai fasa mudah alih. Walau bagaimanapun, apabila menggunakan sistem air tulen (termasuk air tulen atau larutan garam tulen) sebagai fasa mudah alih, rantaian karbon panjang pada fasa pegun C18 lajur cenderung untuk mengelakkan air dan bercampur dengan satu sama lain, mengakibatkan penurunan seketika dalam kapasiti pengekalan lajur atau tidak ada pengekalan. Fenomena ini dipanggil "keruntuhan fasa hidrofobik" (seperti yang ditunjukkan di bahagian kiri Rajah 1). Walaupun keadaan ini boleh diterbalikkan apabila lajur dibasuh dengan pelarut organik seperti metanol atau asetonitril, ia masih boleh menyebabkan kerosakan pada lajur. Oleh itu, adalah perlu untuk menghalang keadaan ini daripada berlaku.
Rajah 1. Rajah skematik fasa terikat pada permukaan gel silika dalam lajur C18 biasa (kiri) dan lajur C18AQ (kanan).
Untuk menangani masalah yang disebutkan di atas, pengeluar bahan pembungkusan kromatografi telah membuat penambahbaikan teknikal. Salah satu daripada penambahbaikan ini adalah membuat beberapa pengubahsuaian pada permukaan matriks silika, seperti pengenalan kumpulan cyano hidrofilik (seperti yang ditunjukkan di bahagian kanan Rajah 1), untuk menjadikan permukaan gel silika lebih hidrofilik. Oleh itu, rantai C18 di permukaan silika dapat dilanjutkan sepenuhnya di bawah keadaan yang sangat berair dan keruntuhan fasa hidrofobik dapat dielakkan. Lajur C18 yang diubah suai ini dipanggil lajur C18 berair, iaitu lajur C18AQ, yang direka untuk keadaan elusi yang sangat berair dan boleh mentolerir sistem berair 100%. Lajur C18AQ telah digunakan secara meluas dalam pemisahan dan pemurnian sebatian kutub yang kuat, termasuk asid organik, peptida, nukleosida dan vitamin larut air.
Desalting adalah salah satu aplikasi tipikal lajur C18AQ dalam pembersihan kilat untuk sampel, yang menghilangkan komponen garam atau penampan dalam pelarut sampel untuk memudahkan penggunaan sampel dalam kajian berikutnya. Dalam jawatan ini, FCF biru cemerlang dengan polariti yang kuat digunakan sebagai sampel dan disucikan pada lajur C18AQ. Pelarut sampel digantikan oleh pelarut organik dari larutan penampan, dengan itu memudahkan penyejatan putar berikut serta penjimatan pelarut dan masa operasi. Selain itu, kesucian sampel telah diperbaiki dengan mengeluarkan beberapa kekotoran dalam sampel.
Bahagian eksperimen
Rajah 2. Struktur kimia sampel.
FCF biru cemerlang digunakan sebagai sampel dalam jawatan ini. Kesucian sampel mentah adalah 86% dan struktur kimia sampel ditunjukkan dalam Rajah 2. Untuk menyediakan penyelesaian sampel, 300 mg serbuk mentah pepejal FCF biru cemerlang dibubarkan dalam larutan penampan 1 m NAH2PO4 dan menggoncang dengan baik untuk menjadi penyelesaian yang jelas. Penyelesaian sampel kemudian disuntik ke dalam lajur Flash oleh penyuntik. Persediaan eksperimen pemurnian kilat disenaraikan dalam Jadual 1.
| Instrumen | Mesin Sepabean ™2 | |||
| Kartrij | 12 G Sepaflash C18 RP Flash Cartridge (Silika Sfera, 20-45 μm, 100 Å, Nombor Pesanan: SW-5222-012-SP) | 12 G Sepaflash C18AQ RP Kartrij Flash (Silika Sfera, 20-45 μm, 100 Å, Nombor Pesanan: SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Panjang gelombang | 254 nm | |||
| Fasa mudah alih | Pelarut A: air Pelarut B: metanol | |||
| Kadar aliran | 30 ml/min | |||
| Memuatkan sampel | 300 mg (FCF biru cemerlang dengan kesucian 86%) | |||
| Kecerunan | Masa (CV) | Pelarut b (%) | Masa (CV) | Pelarut b (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Keputusan dan perbincangan
Kartrij flash RP C18AQ RP digunakan untuk penyucian sampel dan penyucian. Kecerunan langkah digunakan di mana air tulen digunakan sebagai fasa mudah alih pada permulaan elusi dan dijalankan untuk 10 jilid lajur (CV). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, apabila menggunakan air tulen sebagai fasa mudah alih, sampel itu dikekalkan sepenuhnya pada kartrij flash. Seterusnya, metanol dalam fasa mudah alih meningkat secara langsung kepada 100% dan kecerunan dikekalkan untuk 7.5 cv. Sampel itu dihilangkan dari 11.5 hingga 13.5 cv. Dalam pecahan yang dikumpulkan, penyelesaian sampel digantikan daripada penyelesaian penampan NAH2PO4 kepada metanol. Berbanding dengan larutan yang sangat berair, metanol lebih mudah dikeluarkan oleh penyejatan berputar dalam langkah berikutnya, yang memudahkan penyelidikan berikut.
Rajah 3. Kromatogram flash sampel pada kartrij C18AQ.
Untuk membandingkan tingkah laku pengekalan kartrij C18AQ dan kartrij C18 biasa untuk sampel polariti yang kuat, ujian perbandingan selari dilakukan. Kartrij flash Sepaflash C18 RP digunakan dan kromatogram flash untuk sampel ditunjukkan dalam Rajah 4. Untuk kartrij C18 biasa, nisbah fasa berair tertinggi tertinggi adalah kira -kira 90%. Oleh itu, kecerunan permulaan ditetapkan pada metanol 10% dalam air 90%. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4, disebabkan oleh keruntuhan fasa hidrofobik rantai C18 yang disebabkan oleh nisbah berair yang tinggi, sampel itu hampir tidak disimpan pada kartrij C18 biasa dan secara langsung dielakkan oleh fasa mudah alih. Akibatnya, operasi penyahkodan sampel atau pembersihan tidak dapat diselesaikan.
Rajah 4. Kromatogram flash sampel pada kartrij C18 biasa.
Berbanding dengan kecerunan linear, penggunaan kecerunan langkah mempunyai kelebihan berikut:
1. Penggunaan pelarut dan masa berjalan untuk pembersihan sampel dikurangkan.
2. Produk sasaran di atas puncak tajam, yang mengurangkan jumlah pecahan yang dikumpulkan dan dengan itu memudahkan penyejatan berputar berikut serta masa penjimatan.
3. Produk yang dikumpulkan adalah dalam metanol yang mudah disejat, sehingga masa pengeringan dikurangkan.
Kesimpulannya, untuk pemurnian sampel yang sangat kutub atau sangat hidrofilik, sepflash C18AQ RP Cartridges yang menggabungkan dengan sistem kromatografi flash preparatif Sepabean ™ mesin boleh menawarkan penyelesaian yang cepat dan cekap.
Mengenai kartrij flash siri C18 RP Sepaflash
Terdapat satu siri kartrij flash Sepaflash C18AQ dengan spesifikasi yang berbeza dari teknologi SAITAI (seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 2).
| Nombor item | Saiz lajur | Kadar aliran (ml/min) | Max.pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (aq) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (aq) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-52222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (aq) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (aq) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Jadual 2. Sepaflash C18AQ RP Kartrij Flash.
Bahan Pembungkusan: Silika Silika Sfera C18 (AQ), 20-45 μm, 100 Å.
Logy (seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 2).
Masa Post: Aug-27-2018