हाँगचेंग वांग, बो झू
अर्ज R&D केंद्र
परिचय
स्थिर फेज आणि मोबाईल फेजच्या सापेक्ष ध्रुवीयतेनुसार, लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी सामान्य फेज क्रोमॅटोग्राफी (NPC) आणि रिव्हर्स्ड फेज क्रोमॅटोग्राफी (RPC) मध्ये विभागली जाऊ शकते.RPC साठी, मोबाइल फेजची ध्रुवता स्थिर टप्प्यापेक्षा मजबूत आहे.RPC उच्च कार्यक्षमता, चांगले रिझोल्यूशन आणि स्पष्ट धारणा यंत्रणेमुळे लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी सेपरेशन मोडमध्ये सर्वाधिक वापरले जाणारे एक बनले आहे.म्हणून RPC अल्कलॉइड्स, कार्बोहायड्रेट्स, फॅटी ऍसिडस्, स्टिरॉइड्स, न्यूक्लिक ऍसिडस्, एमिनो ऍसिडस्, पेप्टाइड्स, प्रथिने इत्यादींसह विविध ध्रुवीय किंवा गैर-ध्रुवीय संयुगे वेगळे करण्यासाठी आणि शुद्ध करण्यासाठी योग्य आहे. RPC मध्ये, सर्वात सामान्यतः वापरले जाणारे स्थिर टप्पा आहे. सिलिका जेल मॅट्रिक्स जे C18, C8, C4, फिनाइल, सायनो, अमिनो, इत्यादींसह विविध कार्यात्मक गटांशी जोडलेले आहे. या बाँड केलेल्या फंक्शनल गटांमध्ये, सर्वात मोठ्या प्रमाणावर वापरले जाणारे एक C18 आहे.असा अंदाज आहे की 80% पेक्षा जास्त RPC आता C18 बाँड फेज वापरत आहेत.म्हणून C18 क्रोमॅटोग्राफी स्तंभ प्रत्येक प्रयोगशाळेसाठी एक सार्वत्रिक स्तंभ बनला आहे.
जरी C18 कॉलमचा वापर खूप विस्तृत ऍप्लिकेशन्समध्ये केला जाऊ शकतो, तथापि, काही नमुन्यांसाठी जे खूप ध्रुवीय किंवा उच्च हायड्रोफिलिक आहेत, अशा नमुन्यांना शुद्ध करण्यासाठी वापरताना नियमित C18 स्तंभांमध्ये समस्या येऊ शकतात.RPC मध्ये, सामान्यतः वापरले जाणारे इल्युशन सॉल्व्हेंट्स त्यांच्या ध्रुवीयतेनुसार ऑर्डर केले जाऊ शकतात: पाणी < मिथेनॉल < एसीटोनिट्रिल < इथेनॉल < टेट्राहायड्रोफुरान < आयसोप्रोपॅनॉल.या नमुन्यांसाठी (मजबूत ध्रुवीय किंवा उच्च हायड्रोफिलिक) स्तंभावर चांगली धारणा सुनिश्चित करण्यासाठी, जलीय प्रणालीचे उच्च प्रमाण मोबाईल फेज म्हणून वापरणे आवश्यक आहे.तथापि, मोबाइल फेज म्हणून शुद्ध पाणी प्रणाली (शुद्ध पाणी किंवा शुद्ध मीठ द्रावणासह) वापरताना, C18 स्तंभाच्या स्थिर टप्प्यावरील लांब कार्बन साखळी पाणी टाळते आणि एकमेकांमध्ये मिसळते, परिणामी तात्काळ कमी होते. स्तंभाची धारणा क्षमता किंवा अगदी धारणा नाही.या घटनेला "हायड्रोफोबिक फेज कोलॅप्स" असे म्हणतात (आकृती 1 च्या डाव्या भागात दर्शविल्याप्रमाणे).मिथेनॉल किंवा एसीटोनिट्रिल सारख्या सेंद्रिय सॉल्व्हेंट्सने स्तंभ धुतल्यावर ही परिस्थिती उलट करता येण्यासारखी असली तरी, तरीही स्तंभाला नुकसान होऊ शकते.त्यामुळे ही परिस्थिती निर्माण होण्यापासून रोखणे गरजेचे आहे.
आकृती 1. नियमित C18 स्तंभ (डावीकडे) आणि C18AQ स्तंभ (उजवीकडे) मध्ये सिलिका जेलच्या पृष्ठभागावर बाँड केलेल्या टप्प्यांचे योजनाबद्ध आकृती.
वर नमूद केलेल्या समस्यांचे निराकरण करण्यासाठी, क्रोमॅटोग्राफिक पॅकिंग साहित्य उत्पादकांनी तांत्रिक सुधारणा केल्या आहेत.यातील एक सुधारणा म्हणजे सिलिका मॅट्रिक्सच्या पृष्ठभागावर काही बदल करणे, जसे की हायड्रोफिलिक सायनो गटांचा परिचय (आकृती 1 च्या उजव्या भागात दर्शविल्याप्रमाणे), सिलिका जेलची पृष्ठभाग अधिक हायड्रोफिलिक बनवणे.अशा प्रकारे सिलिका पृष्ठभागावरील C18 चेन अत्यंत जलीय परिस्थितीत पूर्णपणे वाढवल्या जाऊ शकतात आणि हायड्रोफोबिक फेज कोसळणे टाळले जाऊ शकते.या सुधारित C18 स्तंभांना जलीय C18 स्तंभ म्हणतात, म्हणजे C18AQ स्तंभ, जे अत्यंत जलीय उत्सर्जन परिस्थितीसाठी डिझाइन केलेले आहेत आणि 100% जलीय प्रणाली सहन करू शकतात.सेंद्रिय आम्ल, पेप्टाइड्स, न्यूक्लियोसाइड्स आणि पाण्यात विरघळणारे जीवनसत्त्वे यासह मजबूत ध्रुवीय संयुगे वेगळे आणि शुद्ध करण्यासाठी C18AQ स्तंभ मोठ्या प्रमाणावर वापरले गेले आहेत.
नमुन्यांसाठी फ्लॅश शुध्दीकरणातील C18AQ स्तंभांच्या विशिष्ट अनुप्रयोगांपैकी एक डिसल्टिंग आहे, जे नंतरच्या अभ्यासांमध्ये नमुना लागू करणे सुलभ करण्यासाठी सॅम्पल सॉल्व्हेंटमधील मीठ किंवा बफर घटक काढून टाकते.या पोस्टमध्ये, मजबूत ध्रुवीयतेसह ब्रिलियंट ब्लू FCF नमुना म्हणून वापरला गेला आणि C18AQ स्तंभावर शुद्ध केला गेला.सॅम्पल सॉल्व्हेंटची जागा बफर सोल्युशनमधून सेंद्रिय सॉल्व्हेंटने बदलली, त्यामुळे पुढील रोटरी बाष्पीभवन तसेच सॉल्व्हेंट्स आणि ऑपरेटिंग वेळेची बचत होते.शिवाय, नमुन्यातील काही अशुद्धता काढून नमुन्याची शुद्धता सुधारली गेली.
प्रायोगिक विभाग
आकृती 2. नमुन्याची रासायनिक रचना.
या पोस्टमध्ये ब्रिलियंट ब्लू FCF नमुना म्हणून वापरला होता.कच्च्या नमुन्याची शुद्धता 86% होती आणि नमुन्याची रासायनिक रचना आकृती 2 मध्ये दर्शविली होती. नमुना द्रावण तयार करण्यासाठी, 300 मिलीग्राम पावडर क्रूड सॉलिड ब्रिलियंट ब्लू FCF 1 M NaH2PO4 बफर सोल्युशनमध्ये विरघळले आणि चांगले हलले. एक पूर्णपणे स्पष्ट उपाय.नमुना सोल्यूशन नंतर इंजेक्टरद्वारे फ्लॅश कॉलममध्ये इंजेक्ट केले गेले.फ्लॅश शुद्धीकरणाचा प्रायोगिक सेटअप तक्ता 1 मध्ये सूचीबद्ध आहे.
| वाद्य | SepaBean™ मशीन2 | |||
| काडतुसे | 12 g SepaFlash C18 RP फ्लॅश काडतूस (गोलाकार सिलिका, 20 - 45 μm, 100 Å, ऑर्डर क्रमांक: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP फ्लॅश काडतूस (गोलाकार सिलिका, 20 - 45 μm, 100 Å, ऑर्डर क्रमांक：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| तरंगलांबी | 254 एनएम | |||
| मोबाइल टप्पा | सॉल्व्हेंट A: पाणी सॉल्व्हेंट बी: मिथेनॉल | |||
| प्रवाह दर | 30 मिली/मिनिट | |||
| नमुना लोड करत आहे | 300 मिग्रॅ (86% शुद्धतेसह ब्रिलियंट ब्लू एफसीएफ) | |||
| प्रवण | वेळ (CV) | सॉल्व्हेंट बी (%) | वेळ (CV) | सॉल्व्हेंट बी (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| १०.१ | 100 | १०.१ | 100 | |
| १७.५ | 100 | १७.५ | 100 | |
| १७.६ | 10 | १७.६ | 0 | |
| २२.६ | 10 | २२.६ | 0 | |
परिणाम आणि चर्चा
एक SepaFlash C18AQ RP फ्लॅश काडतूस नमुना डिसल्टिंग आणि शुद्धीकरणासाठी वापरला गेला.स्टेप ग्रेडियंटचा वापर केला गेला ज्यामध्ये शुद्ध पाण्याचा वापर मोबाइल फेज म्हणून इल्युशनच्या सुरूवातीस केला गेला आणि 10 कॉलम व्हॉल्यूम (CV) साठी चालवला गेला.आकृती 3 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, मोबाइल फेज म्हणून शुद्ध पाणी वापरताना, नमुना फ्लॅश काड्रिजवर पूर्णपणे राखून ठेवला होता.पुढे, मोबाईल फेजमधील मिथेनॉल थेट 100% पर्यंत वाढविण्यात आले आणि ग्रेडियंट 7.5 CV साठी राखला गेला.नमुना 11.5 ते 13.5 CV मधून बाहेर काढण्यात आला.गोळा केलेल्या अपूर्णांकांमध्ये, नमुना द्रावण NaH2PO4 बफर सोल्यूशनमधून मिथेनॉलमध्ये बदलले गेले.अत्यंत जलीय द्रावणाशी तुलना केल्यास, पुढील चरणात रोटरी बाष्पीभवनाद्वारे मिथेनॉल काढणे खूप सोपे होते, जे पुढील संशोधनास सुलभ करते.
आकृती 3. C18AQ कार्ट्रिजवरील नमुन्याचा फ्लॅश क्रोमॅटोग्राम.
मजबूत ध्रुवीयतेच्या नमुन्यांसाठी C18AQ काडतूस आणि नियमित C18 काडतूस यांच्या धारणा वर्तनाची तुलना करण्यासाठी, समांतर तुलना चाचणी केली गेली.एक SepaFlash C18 RP फ्लॅश काडतूस वापरला गेला आणि नमुन्यासाठी फ्लॅश क्रोमॅटोग्राम आकृती 4 मध्ये दर्शविला गेला. नियमित C18 काडतुसेसाठी, सर्वाधिक सहन केले जाणारे जलीय फेज प्रमाण सुमारे 90% आहे.म्हणून प्रारंभ ग्रेडियंट 90% पाण्यात 10% मिथेनॉलवर सेट केला गेला.आकृती 4 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, उच्च जलीय गुणोत्तरामुळे C18 साखळ्यांच्या हायड्रोफोबिक फेज कोसळल्यामुळे, नमुना नियमित C18 काडतूसवर केवळ राखून ठेवला गेला आणि मोबाइल फेजद्वारे थेट बाहेर काढला गेला.परिणामी, सॅम्पल डिसल्टिंग किंवा शुद्धीकरणाचे ऑपरेशन पूर्ण होऊ शकत नाही.
आकृती 4. नियमित C18 कार्ट्रिजवरील नमुन्याचा फ्लॅश क्रोमॅटोग्राम.
रेखीय ग्रेडियंटशी तुलना करताना, स्टेप ग्रेडियंटच्या वापराचे खालील फायदे आहेत:
1. सॉल्व्हेंटचा वापर आणि नमुना शुद्धीकरणासाठी धावण्याची वेळ कमी केली आहे.
2. लक्ष्‍य उत्पादन तीव्र शिखरावर उत्‍पन्‍न होते, ज्यामुळे संकलित अपूर्णांकांचे प्रमाण कमी होते आणि त्यामुळे पुढील रोटरी बाष्पीभवन तसेच वेळेची बचत होते.
3. गोळा केलेले उत्पादन मिथेनॉलमध्ये असते जे बाष्पीभवन करणे सोपे असते, त्यामुळे कोरडे होण्याची वेळ कमी होते.
शेवटी, नमुन्याच्या शुद्धीकरणासाठी जो मजबूत ध्रुवीय किंवा उच्च हायड्रोफिलिक आहे, SepaFlash C18AQ RP फ्लॅश काडतुसे प्रीपेरेटिव्ह फ्लॅश क्रोमॅटोग्राफी सिस्टीम SepaBean™ मशीन एक जलद आणि कार्यक्षम उपाय देऊ शकतात.
SepaFlash बॉन्डेड सीरीज C18 RP फ्लॅश काडतुसे बद्दल
संताई टेक्नॉलॉजीच्या वेगवेगळ्या वैशिष्ट्यांसह SepaFlash C18AQ RP फ्लॅश काडतुसेची मालिका आहे (तक्ता 2 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे).
| आयटम क्रमांक | स्तंभ आकार | प्रवाह दर (mL/min) | कमाल.दाब (पीएसआय/बार) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 ग्रॅम | 5-15 | ४००/२७.५ |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 ग्रॅम | 10-25 | ४००/२७.५ |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 ग्रॅम | 10-25 | ४००/२७.५ |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 ग्रॅम | 15-30 | ४००/२७.५ |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 ग्रॅम | 25-50 | ३५०/२४.० |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 ग्रॅम | 30-60 | ३००/२०.७ |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 ग्रॅम | 40-80 | ३००/२०.७ |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 ग्रॅम | 40-80 | 250/17.2 |
तक्ता 2. SepaFlash C18AQ RP फ्लॅश काडतुसे.
पॅकिंग साहित्य: उच्च-कार्यक्षमता गोलाकार C18(AQ)-बॉन्डेड सिलिका, 20 - 45 μm, 100 Å.
तर्कशास्त्र (सारणी 2 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे).
पोस्ट वेळ: ऑगस्ट-27-2018