Руи Хуанг, Бо Ксу
Центар за истражување и развој на апликации
Вовед
Пептидот е соединение составено од амино киселини, од кои секоја има уникатни физички и хемиски својства поради различните типови и редослед на остатоци од аминокиселини што ја сочинуваат неговата низа.Со развојот на хемиската синтеза во цврста фаза, хемиската синтеза на различни активни пептиди постигна голем напредок.Сепак, поради комплицираниот состав на пептидот добиен со синтеза на цврста фаза, финалниот производ треба да се прочисти со сигурни методи на сепарација.Најчесто користените методи за прочистување на пептидите вклучуваат хроматографија за размена на јони (IEC) и течна хроматографија со високи перформанси со обратна фаза (RP-HPLC), кои ги имаат недостатоците на низок капацитет за вчитување на примерокот, висока цена на медиумот за сепарација, комплицирана и скапа опрема за сепарација, итн. За брзо прочистување на пептиди со мали молекули (MW < 1 kDa), претходно беше објавена успешна апликација од Santai Technologies, во која кертриџот SepaFlash RP C18 беше искористен за брзо прочистување на тимопентин (TP-5) и добиен е целен производ кој ги исполнува барањата.
Слика 1. 20 вообичаени амино киселини (репродуцирано од www.bachem.com).
Постојат 20 видови на амино киселини кои се вообичаени во составот на пептидите.Овие амино киселини можат да се поделат во следните групи според нивниот поларитет и киселинско-базното својство: неполарни (хидрофобни), поларни (ненаполнети), кисели или базни (како што е прикажано на слика 1).Во пептидна секвенца, ако аминокиселините што ја сочинуваат низата се претежно поларни (како што е означено со розова боја на слика 1), како што се цистеин, глутамин, аспарагин, серин, треонин, тирозин итн. тогаш овој пептид може да има силна поларитет и да биде високо растворлив во вода.За време на процедурата за прочистување на овие примероци од силни поларни пептиди со хроматографија со обратна фаза, ќе се појави феномен наречен хидрофобен фазен колапс (видете на претходно објавена белешка за апликација од Santai Technologies: хидрофобна фаза колапс, AQ колони за хроматографија со обратна фаза и нивни апликации).Во споредба со обичните C18 колони, подобрените C18AQ колони се најпогодни за прочистување на силни поларни или хидрофилни примероци.Во овој пост, силен поларен пептид беше искористен како примерок и прочистен со колона C18AQ.Како резултат на тоа, целниот производ кој ги исполнува барањата беше добиен и може да се користи во следните истражувања и развој.
| Инструмент | SepaBean™машина 2 | |||
| Касети | 12 g SepaFlash C18 RP блиц-кертриџ (сферична силика, 20 - 45 μm, 100 Å, број на нарачка: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP блиц-кертриџ (сферична силика, 20 - 45 μm, 100 Å, број на нарачка: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Бранова должина | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Мобилна фаза | Растворувач А: Вода Растворувач Б: ацетонитрил | |||
| Проток | 15 мл/мин | 20 мл/мин | ||
| Вчитување на примерокот | 30 mg | |||
| Градиент | Време (CV) | Растворувач Б (%) | Време (мин.) | Растворувач Б (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Резултати и дискусија
За да ги споредиме перформансите на прочистување за примерокот од поларниот пептид помеѓу редовната колона C18 и колоната C18AQ, користевме редовна колона C18 за блиско прочистување на примерокот како почеток.Како што е прикажано на Слика 2, поради колапсот на хидрофобната фаза на синџирите C18 предизвикан од високиот воден однос, примерокот едвај се задржа на обичниот кертриџ C18 и беше директно елуиран од мобилната фаза.Како резултат на тоа, примерокот не беше ефективно одделен и прочистен.
Слика 2. Флеш хроматограм на примерокот на обичен кертриџ C18.
Следно, користевме колона C18AQ за блиско прочистување на примерокот.Како што е прикажано на Слика 3, пептидот бил ефикасно задржан на колоната и потоа елуиран.Целниот производ беше одвоен од нечистотиите во суровиот примерок и собран.По лиофилизацијата и потоа анализиран со HPLC, прочистениот производ има чистота од 98,2% и може дополнително да се користи за следен чекор истражување и развој.
Слика 3. Флеш хроматограм на примерокот на патрон C18AQ.
Како заклучок, флеш кертриџот SepaFlash C18AQ RP во комбинација со системот за флеш хроматографија SepaBean™машината може да понуди брзо и ефикасно решение за прочистување на силни поларни или хидрофилни примероци.
Има серија блиц касети SepaFlash C18AQ RP со различни спецификации од Santai Technology (како што е прикажано во Табела 2).
| Точка број | Големина на колона | Проток (mL/min) | Макс.Притисок (psi/бар) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 гр | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 гр | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 гр | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 гр | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 гр | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 гр | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 гр | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 гр | 40-80 | 250/17.2 |
Табела 2. блиц касети SepaFlash C18AQ RP.Материјали за пакување: Високо-ефикасна сферична C18(AQ)-врзана силика, 20 - 45 μm, 100 Å.
За понатамошни информации за деталните спецификации на машината SepaBean™ или информациите за нарачка на флеш касетите од серијата SepaFlash, посетете ја нашата веб-локација.
Време на објавување: Октомври-12-2018 година