Хонгченг Ванг, Бо Ксу
Центар за истражување и развој на апликации
Вовед
Според релативните поларитети на стационарната фаза и мобилната фаза, течната хроматографија може да се подели на нормална фаза хроматографија (NPC) и обратна фаза хроматографија (RPC).За RPC, поларитетот на мобилната фаза е посилен од оној на стационарната фаза.RPC стана најшироко користен во режимите на одвојување на течна хроматографија поради неговата висока ефикасност, добрата резолуција и јасното задржување на механизмот.Затоа RPC е погоден за одвојување и прочистување на различни поларни или неполарни соединенија, вклучувајќи алкалоиди, јаглени хидрати, масни киселини, стероиди, нуклеински киселини, амино киселини, пептиди, протеини итн. Во RPC, најчесто користената стационарна фаза е матрицата на силика гел која е поврзана со различни функционални групи, вклучувајќи C18, C8, C4, фенил, цијано, амино, итн. Меѓу овие сврзани функционални групи, најшироко користена е C18.Се проценува дека повеќе од 80% од RPC сега користат C18 споена фаза.Затоа, колоната за хроматографија C18 стана задолжителна универзална колона за секоја лабораторија.
Иако колоната C18 може да се користи во многу широк опсег на апликации, сепак, за некои примероци кои се многу поларни или високо хидрофилни, обичните колони C18 може да имаат проблеми кога се користат за прочистување на таквите примероци.Во RPC, најчесто користените растворувачи за елуција може да се нарачаат според нивниот поларитет: вода < метанол < ацетонитрил < етанол < тетрахидрофуран < изопропанол.За да се обезбеди добро задржување на колоната за овие примероци (силни поларни или високохидрофилни), висок процент на воден систем е неопходен да се користи како мобилна фаза.Меѓутоа, кога се користи систем за чиста вода (вклучувајќи чиста вода или раствор на чиста сол) како мобилна фаза, долгиот јаглероден ланец на стационарната фаза на колоната C18 има тенденција да ја избегнува водата и да се меша меѓу себе, што резултира со моментално намалување на капацитет на задржување на колоната или дури и без задржување.Овој феномен се нарекува „хидрофобен фазен колапс“ (како што е прикажано во левиот дел од Слика 1).Иако оваа ситуација е реверзибилна кога колоната се мие со органски растворувачи како што се метанол или ацетонитрил, сепак може да предизвика оштетување на колоната.Затоа, неопходно е да се спречи оваа ситуација да се случи.
Слика 1. Шематски дијаграм на сврзаните фази на површината на силика гел во правилна колона C18 (лево) и C18AQ колона (десно).
За да се решат горенаведените проблеми, производителите на хроматографски материјали за пакување направија технички подобрувања.Едно од овие подобрувања е правењето некои модификации на површината на силика матрицата, како што е воведувањето на хидрофилни цијано групи (како што е прикажано во десниот дел на Слика 1), за да се направи површината на силика гелот похидрофилна.Така синџирите C18 на површината на силициум диоксид може целосно да се прошират под високо водни услови и да се избегне колапс на хидрофобната фаза.Овие модифицирани C18 колони се нарекуваат водени C18 колони, имено C18AQ колони, кои се дизајнирани за високо водени услови на елуирање и можат да толерираат 100% воден систем.Колоните C18AQ се широко применети за одвојување и прочистување на силни поларни соединенија, вклучувајќи органски киселини, пептиди, нуклеозиди и витамини растворливи во вода.
Расчистувањето со сол е една од типичните примени на колоните C18AQ во блицот за прочистување на примероците, со што се отстрануваат солта или пуферските компоненти во растворувачот на примерокот за да се олесни примената на примерокот во следните студии.Во овој пост, Brilliant Blue FCF со силен поларитет беше искористен како примерок и прочистен на колоната C18AQ.Растворувачот на примерокот беше заменет со органски растворувач од пуфер раствор, со што се олеснува следното ротирачко испарување, како и заштеда на растворувачи и време на работа.Понатаму, чистотата на примерокот беше подобрена со отстранување на некои нечистотии во примерокот.
Експериментален дел
Слика 2. Хемиската структура на примерокот.
Брилијантното сино FCF беше искористено како примерок во овој пост.Чистотата на суровиот примерок беше 86%, а хемиската структура на примерокот беше прикажана на слика 2. За да се подготви растворот на примерокот, 300 mg прашкаст суров цврст цврст од Brilliant Blue FCF беше растворен во 1 M NaH2PO4 пуфер раствор и добро протресен за да стане целосно јасен раствор.Решението на примерокот потоа се инјектира во колоната за блиц со инјектор.Експерименталното поставување на блицот за прочистување е наведено во Табела 1.
| Инструмент | Машина SepaBean™2 | |||
| Касети | 12 g SepaFlash C18 RP блиц-кертриџ (сферична силика, 20 - 45 μm, 100 Å, број на нарачка: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP блиц-кертриџ (сферична силика, 20 - 45 μm, 100 Å, број на нарачка: SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| Бранова должина | 254 nm | |||
| Мобилна фаза | Растворувач А: Вода Растворувач Б: метанол | |||
| Проток | 30 мл/мин | |||
| Вчитување на примерокот | 300 mg (Brilliant Blue FCF со чистота од 86%) | |||
| Градиент | Време (CV) | Растворувач Б (%) | Време (CV) | Растворувач Б (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Резултати и дискусија
Се користеше флеш кертриџ SepaFlash C18AQ RP за десолење и прочистување на примерокот.Беше искористен градиентот на чекорот во кој се користеше чиста вода како мобилна фаза на почетокот на елуцијата и се протега за 10 волумени на колони (CV).Како што е прикажано на слика 3, кога се користи чиста вода како мобилна фаза, примерокот целосно се задржал на флеш-кертриџот.Потоа, метанолот во мобилната фаза беше директно зголемен на 100% и градиентот беше задржан за 7,5 CV.Примерокот беше елуиран од 11,5 до 13,5 CV.Во собраните фракции, растворот од примерокот беше заменет од пуфер раствор на NaH2PO4 во метанол.Во споредба со високо воден раствор, метанолот беше многу полесно да се отстрани со ротационо испарување во следниот чекор, што го олеснува следното истражување.
Слика 3. Флеш хроматограм на примерокот на патрон C18AQ.
За да се спореди однесувањето на задржување на патронот C18AQ и обичниот кертриџ C18 за примероци со силен поларитет, беше изведен паралелен споредбен тест.Користена е флеш-кертриџот SepaFlash C18 RP и флеш-хроматограмот за примерокот е прикажан на слика 4. За обичните касети C18, највисокиот толериран сооднос на водена фаза е околу 90%.Затоа, почетниот градиент беше поставен на 10% метанол во 90% вода.Како што е прикажано на слика 4, поради колапсот на хидрофобната фаза на синџирите C18 предизвикан од високиот воден однос, примерокот едвај се задржа на обичниот кертриџ C18 и беше директно елуиран од мобилната фаза.Како резултат на тоа, операцијата на отстранување или прочистување на примерокот не може да се заврши.
Слика 4. Флеш хроматограм на примерокот на обичен кертриџ C18.
Во споредба со линеарниот градиент, употребата на чекор градиент ги има следните предности:
1. Употребата на растворувач и времето на работа за прочистување на примерокот е намалено.
2. Целниот производ елуира во остар врв, што го намалува волуменот на собраните фракции и на тој начин го олеснува следното ротирачко испарување, како и заштеда на време.
3. Собраниот производ е во метанол кој лесно се испарува, со што се намалува времето на сушење.
Како заклучок, за прочистување на примерокот кој е силно поларен или високохидрофилен, флеш касетите SepaFlash C18AQ RP комбинирани со подготвителниот флеш хроматографија систем SepaBean™ Machine би можеле да понудат брзо и ефикасно решение.
За блиц касетите SepaFlash Bonded Series C18 RP
Има серија блиц касети SepaFlash C18AQ RP со различни спецификации од Santai Technology (како што е прикажано во Табела 2).
| Точка број | Големина на колона | Проток (mL/min) | Макс.Притисок (psi/бар) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 гр | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 гр | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 гр | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 гр | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 гр | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 гр | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 гр | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 гр | 40-80 | 250/17.2 |
Табела 2. блиц касети SepaFlash C18AQ RP.
Материјали за пакување: Високо-ефикасна сферична C18(AQ)-врзана силика, 20 - 45 μm, 100 Å.
логија (како што е прикажано во Табела 2).
Време на објавување: 27.08.2018