Хонгченг Ванг, Бо Ку
Центар за апликација R&D
Вовед
Според релативните поларитети на стационарната фаза и мобилната фаза, течната хроматографија може да се подели во нормална фаза на хроматографија (NPC) и обратна фаза на хроматографија (RPC). За RPC, поларитетот на мобилната фаза е посилна од онаа на стационарната фаза. RPC стана најшироко користена во режимите за раздвојување на течна хроматографија, како резултат на неговата висока ефикасност, добра резолуција и механизам за јасен задржување. Затоа RPC е погоден за раздвојување и прочистување на разни поларни или непаларни соединенија, вклучувајќи алкалоиди, јаглени хидрати, масни киселини, стероиди, нуклеински киселини, аминокиселини, пептиди, протеини, итн. Циано, амино, итн. Меѓу овие врзани функционални групи, најчесто користениот е C18. Се проценува дека повеќе од 80% од RPC сега користат фаза на врзана C18. Затоа, колоната C18 хроматографија стана универзална колона што мора да ја има за секоја лабораторија.
Иако колоната C18 може да се користи во многу широк спектар на апликации, сепак, за некои примероци што е многу поларна или високо хидрофилна, редовни колони C18 може да имаат проблеми кога се користат за прочистување на ваквите примероци. Во RPC, најчесто користените растворувачи на елиција можат да се нарачаат според нивната поларитет: вода <метанол <ацетонитрил <етанол <тетрахидрофуран <изопропанол. За да се обезбеди добро задржување на колоната за овие примероци (силен поларен или високо хидрофилен), неопходно е да се користи висок дел од водниот систем како мобилна фаза. Меѓутоа, кога користите систем за чиста вода (вклучително и чиста вода или раствор на чиста сол) како мобилна фаза, долгиот ланец на јаглерод на стационарната фаза на колоната C18 има тенденција да ја избегне водата и да се меша едни со други, што резултира во моментално намалување на капацитетот за задржување на колоната или дури и нема задржување. Овој феномен се нарекува „колапс на хидрофобна фаза“ (како што е прикажано на левиот дел од Слика 1). Иако оваа состојба е реверзибилна кога колоната се мие со органски растворувачи како што се метанол или ацетонитрил, сепак може да предизвика оштетување на колоната. Затоа, неопходно е да се спречи оваа состојба да се случи.
Слика 1. Шематски дијаграм на врзаните фази на површината на силика гел во редовна колона C18 (лево) и колона C18AQ (десно).
За решавање на горенаведените проблеми, производителите на хроматографски материјали за пакување направија технички подобрувања. Едно од овие подобрувања е да се направат некои модификации на површината на силициумската матрица, како што е воведувањето на хидрофилни цијано групи (како што е прикажано на десниот дел од Слика 1), за да се направи површината на силика гел повеќе хидрофилен. Така, синџирите C18 на површината на силика може да бидат целосно проширени под многу водни услови и може да се избегне колапс на хидрофобна фаза. Овие модифицирани колони C18 се нарекуваат водни колони C18, имено колони C18AQ, кои се дизајнирани за високо водни услови за елиминација и можат да толерираат 100% воден систем. Колоните C18AQ се широко применети во раздвојувањето и прочистувањето на силните поларни соединенија, вклучувајќи органски киселини, пептиди, нуклеозиди и витамини растворливи во вода.
Desalting е една од типичните апликации на колоните C18AQ во прочистувањето на блицот за примероците, што ги отстранува компонентите на сол или тампон во растворувачот на примерокот за да се олесни примената на примерокот во последователните студии. Во овој пост, како примерок се користеше брилијантниот сина FCF со силна поларитет и се прочистуваше на колоната C18AQ. Растворувачот на примерокот беше заменет со органски растворувач од тампон раствор, со што се олеснува следното ротирачко испарување, како и заштеда на растворувачи и време на работа. Понатаму, чистотата на примерокот беше подобрена со отстранување на некои нечистотии во примерокот.
Експериментален дел
Слика 2. Хемиската структура на примерокот.
Брилијантната сина FCF се користеше како примерок во овој пост. Чистотата на суровиот примерок беше 86%, а хемиската структура на примерокот беше прикажана на Слика 2. За да се подготви растворот на примерокот, 300 мг прашкаста сурова цврста цврста форма на брилијантна сина FCF беше растворена во тампон раствор од 1 m NaH2PO4 и добро се затресе за да стане целосно јасен раствор. Растворот за примерок потоа беше вбризгуван во колоната Флеш од страна на инјектор. Експерименталното поставување на прочистувањето на блицот е наведено во Табела 1.
| Инструмент | Сепабија ™ машина2 | |||
| Касети | 12 g Sepaflash C18 RP Flash кертриџ (сферична силика, 20-45 μm, 100 Å, број на нарачка: SW-5222-012-SP) | 12 g Sepaflash C18AQ RP Flash Certridge (сферична силика, 20-45 μm, 100 Å, број на нарачка ： SW-5222-012-SP (aq)） | ||
| Бранова должина | 254 nm | |||
| Мобилна фаза | Растворувач a ： вода Растворувач Б ： Метанол | |||
| Стапка на проток | 30 мл/мин | |||
| Вчитување на примерокот | 300 мг (брилијантно сино FCF со чистота од 86%) | |||
| Градиент | Време (CV) | Растворувач Б (%) | Време (CV) | Растворувач Б (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Резултати и дискусија
Се користеше кертриџ за блиц Sepaflash C18AQ RP за десетирање и прочистување на примерокот. Чекор градиент се користеше во кој се користеше чиста вода како мобилна фаза на почетокот на елуицијата и се работи за 10 тома на колони (CV). Како што е прикажано на Слика 3, кога се користи чиста вода како мобилна фаза, примерокот беше целосно задржан на кертриџот на блицот. Следно, метанолот во мобилната фаза беше директно зголемен на 100% и градиентот се одржуваше за 7,5 CV. Примерокот беше елитиран од 11,5 до 13,5 CV. Во собраните фракции, растворот на примерокот беше заменет од тампон раствор NAH2PO4 на метанол. Споредувајќи се со високо воден раствор, метанолот беше многу полесно да се отстрани со ротационо испарување во последователниот чекор, што го олеснува следното истражување.
Слика 3. Флеш хроматограм на примерокот на кертриџ C18AQ.
За да се спореди однесувањето на задржување на кертриџот C18AQ и редовниот кертриџ C18 за примероци на силна поларитет, беше извршен тест за паралелна споредба. Користена е сепафлаш C18 RP Flash кертриџ и флеш хроматограмот за примерокот беше прикажан на Слика 4. За редовни касети C18, најголем однос на толерираниот воден фаза е околу 90%. Затоа, почетниот градиент беше поставен на 10% метанол во 90% вода. Како што е прикажано на Слика 4, поради хидрофобната фаза на колапсот на синџирите C18 предизвикани од високиот воден сооднос, примерокот едвај се задржа на редовниот кертриџ C18 и беше директно елитиран од мобилната фаза. Како резултат, работењето на примерокот за десетирање или прочистување не може да се заврши.
Слика 4. Флеш хроматограм на примерокот на редовна кертриџ C18.
Споредбата со линеарниот градиент, употребата на градиент на чекор ги има следниве предности:
1. Употреба на растворувач и време на извршување на прочистување на примерокот е намалена.
2. Целниот производ се еликува во остар врв, што го намалува обемот на собраните фракции и со тоа го олеснува следното ротирачко испарување, како и заштеда на време.
3. Собраниот производ е во метанол кој е лесно да се испари, со што времето на сушење е намалено.
Како заклучок, за прочистување на примерокот кој е силно поларен или високо хидрофилен, Sepaflash C18AQ RP Flash Castridges, комбинирајќи се со подготвителниот систем на флеш хроматографија SEPABEAN ™ машина може да понуди брзо и ефикасно решение.
За касетите со блиц серија Sepaflash C18 RP Flash
Постојат серија на касети за блиц Flash C18AQ RP со различни спецификации од технологијата Santai (како што е прикажано во Табела 2).
| Број на артикал | Големина на колоната | Стапка на проток (ml/min) | Макс.Прс (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Табела 2. Сепафлаш C18AQ RP Clash Castridges.
Материјали за пакување: високо-ефикасно сферичен C18 (AQ) -БОНДИЛЕН СИЛИЦА, 20-45 μM, 100.
логи (како што е прикажано во Табела 2).
Време на објавување: август-27-2018 година