Hongcheng Wang, Bo Xu
Application R&D Center
Sava lalana
Araka ny fiovaovan'ny toetran'ny dingan'ny fijanonana sy ny dingana finday, ny chromatography ranoka dia azo zaraina amin'ny chromatography phase normal (NPC) sy ny chromatography phase reversed (RPC).Ho an'ny RPC, ny polarity amin'ny dingana finday dia matanjaka kokoa noho ny an'ny dingana mijanona.Ny RPC dia lasa be mpampiasa indrindra amin'ny fomba fisarahana amin'ny chromatography ranoka noho ny fahombiazany avo lenta, ny fanapahan-kevitra tsara ary ny rafitra fitazonana mazava.Noho izany, ny RPC dia mety amin'ny fisarahana sy fanadiovana ny polar na tsy polar isan-karazany, anisan'izany ny alkaloid, gliosida, asidra matavy, steroïde, asidra nukleika, asidra amine, peptides, proteinina, sns. ny silica gel matrix izay mifamatotra amin'ny vondrona miasa isan-karazany, anisan'izany ny C18, C8, C4, phenyl, cyano, amino, sns. Amin'ireo vondrona miasa mifamatotra ireo, ny tena be mpampiasa dia C18.Tombanana fa maherin'ny 80% amin'ny RPC izao no mampiasa dingana mifatotra C18.Noho izany, ny tsanganana chromatography C18 dia lasa tsanganana manerantany tsy maintsy ananana ho an'ny laboratoara tsirairay.
Na dia azo ampiasaina amin'ny fampiharana maro be aza ny tsanganana C18, na izany aza, ho an'ny santionany sasany izay tena polar na hydrophilic be dia be, ny tsanganana C18 mahazatra dia mety hanana olana rehefa ampiasaina hanadiovana ireo santionany ireo.Ao amin'ny RPC, ny solvent elution fampiasa matetika dia azo alaina araka ny fahasamihafan'izy ireo: rano < methanol < acetonitrile < ethanol < tetrahydrofuran < isopropanol.Mba hiantohana ny fitehirizana tsara amin'ny tsanganana ho an'ireo santionany ireo (polar matanjaka na hydrophilic be), dia ilaina ny ampahany betsaka amin'ny rafitra misy rano ampiasaina ho toy ny dingana mihetsika.Na izany aza, rehefa mampiasa rafitra rano madio (anisan'izany ny rano madio na vahaolana sira madio) ho toy ny dingana finday, ny rojo karbaona lava eo amin'ny dingana mijoro amin'ny tsanganana C18 dia mirona hisoroka ny rano sy hifangaro amin'ny tsirairay, ka miteraka tampoka ny fihenan'ny fahafahana mitazona ny tsanganana na tsy misy fitazonana mihitsy aza.Ity trangan-javatra ity dia antsoina hoe "fianjeran'ny dingana hydrophobic" (araka ny aseho eo amin'ny ilany havia amin'ny sary 1).Na dia azo ovaina aza izany toe-javatra izany rehefa sasana amin'ny solvents organika toy ny methanol na acetonitrile ny tsanganana, dia mbola mety hiteraka fahasimbana amin'ny tsanganana izany.Noho izany dia ilaina ny misoroka izany toe-javatra izany.
Sary 1. Ny kisary schematic amin'ireo dingana mifamatotra eo amin'ny tampon'ny silica gel amin'ny tsanganana C18 mahazatra (ankavia) sy tsanganana C18AQ (ankavanana).
Mba hamahana ireo olana voalaza etsy ambony ireo dia nanao fanatsarana ara-teknika ny mpanamboatra fitaovana famonosana chromatographic.Ny iray amin'ireo fanatsarana ireo dia ny fanaovana fanovana sasany eo amin'ny tontolon'ny silica matrix, toy ny fampidirana vondrona cyano hydrophilic (araka ny aseho eo amin'ny ilany havanana amin'ny sary 1), mba hahatonga ny endrik'ilay gel silica hydrophilic kokoa.Noho izany, ny rojo C18 eo amin'ny tampon'ny silica dia mety hiitatra tanteraka amin'ny toe-javatra misy rano be ary azo alaina ny firodanan'ny hydrophobic.Ireo tsanganana C18 novaina ireo dia antsoina hoe tsanganana C18 rano, izany hoe tsanganana C18AQ, izay natao ho an'ny toe-javatra misy rano be dia be ary afaka mandefitra ny rafitra aqueous 100%.Ny tsanganana C18AQ dia nampiharina be tamin'ny fisarahana sy ny fanadiovana ny polar compounds, anisan'izany ny asidra organika, ny peptides, ny nucleosides ary ny vitaminina azo levona amin'ny rano.
Ny desalting dia iray amin'ireo fampiharana mahazatra amin'ny tsanganana C18AQ amin'ny fanadiovana tselatra ho an'ny santionany, izay manaisotra ny sira na singa buffer ao amin'ny solvent santionany mba hanamora ny fampiharana ny santionany amin'ny fianarana manaraka.Amin'ity lahatsoratra ity, ny Brilliant Blue FCF miaraka amin'ny polarity matanjaka dia nampiasaina ho santionany ary nodiovina tamin'ny tsanganana C18AQ.Ny solvent santionany dia nosoloina solvent organika avy amin'ny vahaolana buffer, ka manamora ny fihodinan'ny rotary manaraka ary mamonjy solvents sy ny fotoana fiasana.Fanampin'izany, nohatsaraina ny fahadiovan'ny santionany tamin'ny fanesorana ireo loto sasany tao anatin'ilay santionany.
Fizarana andrana
Sary 2. Ny rafitra simika amin'ny santionany.
Ny Brilliant Blue FCF dia nampiasaina ho santionany amin'ity lahatsoratra ity.Ny fahadiovan'ny santionany manta dia 86% ary ny rafitra simika ny santionany dia aseho amin'ny sary 2. Mba hanomanana ny santionany vahaolana, 300 mg powdery crude solid of Brilliant Blue FCF dia levona tao amin'ny 1 M NaH2PO4 buffer solution ary nihozongozona tsara mba ho lasa. vahaolana mazava tanteraka.Ny vahaolana santionany dia natsindrona tao amin'ny tsanganana tselatra tamin'ny alalan'ny injector.Ny fametrahana andrana amin'ny fanadiovana tselatra dia voatanisa ao amin'ny tabilao 1.
| fitaovana | Machine SepaBean™2 | |||
| Cartridges | 12 g SepaFlash C18 RP tselatra cartridge (silika boribory, 20 - 45 μm, 100 Å, laharana baiko: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP flash cartridge (silika boribory, 20 - 45 μm, 100 Å, laharana baiko:SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| halavan'ny onjam | 254 nm | |||
| Dingana finday | Solvent A: Rano Solvent B: Metanol | |||
| tahan'ny fikoriana | 30 mL/min | |||
| Sample loading | 300 mg (Brilliant Blue FCF miaraka amin'ny fahadiovan'ny 86%) | |||
| gradient | Ora (CV) | Solvent B (%) | Ora (CV) | Solvent B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Valiny sy dinika
Ny cartridge tselatra SepaFlash C18AQ RP dia nampiasaina tamin'ny fanadiovana sy fanadiovana santionany.Ny gradient dingana dia nampiasaina tamin'ny fampiasana rano madio ho toy ny dingana mihetsika amin'ny fanombohan'ny elution ary mihazakazaka ho an'ny tsanganana 10 (CV).Araka ny aseho amin'ny sary 3, rehefa mampiasa rano madio ho toy ny dingana finday, ny santionany dia voatazona tanteraka amin'ny cartridge flash.Manaraka, ny methanol ao amin'ny dingana finday dia nitombo mivantana ho 100% ary ny gradient dia nitazona ny 7.5 CV.Ny santionany dia nesorina avy amin'ny 11.5 ka hatramin'ny 13.5 CV.Ao amin'ny ampahany voaangona, ny vahaolana santionany dia nosoloina avy amin'ny vahaolana buffer NaH2PO4 ho methanol.Raha ampitahaina amin'ny vahaolana misy rano be, dia mora kokoa ny nesorina tamin'ny alalan'ny etona mihodina amin'ny dingana manaraka ny methanol, izay manamora ny fikarohana manaraka.
Figure 3. Ny chromatogram flash amin'ny santionany amin'ny carte C18AQ.
Mba hampitahana ny fihetsika fitazonana ny cartridge C18AQ sy ny cartridge C18 mahazatra ho an'ny santionan'ny polarity matanjaka, dia natao ny fitsapana fampitahana parallèle.Nisy cartridge tselatra SepaFlash C18 RP nampiasaina ary ny chromatogram tselatra ho an'ny santionany dia aseho amin'ny sary 4. Ho an'ny cartridges C18 mahazatra, ny tahan'ny ranon-drano azo leferina avo indrindra dia eo amin'ny 90%.Noho izany, ny gradient fanombohana dia napetraka amin'ny 10% methanol amin'ny rano 90%.Araka ny asehon'ny sary 4, noho ny firodanan'ny dingana hydrophobic ny rojo C18 vokatry ny tahan'ny rano be dia be, ny santionany dia zara raha voatazona amin'ny cartridge C18 mahazatra ary nesorina mivantana tamin'ny alàlan'ny dingana finday.Vokatr'izany dia tsy vita ny fampandehanana ny santionany fanariana sira na fanadiovana.
Figure 4. Ny chromatogram flash amin'ny santionany amin'ny cartridge C18 mahazatra.
Raha ampitahaina amin'ny gradient linear, ny fampiasana ny gradient dingana dia manana tombony manaraka:
1. Mihena ny fampiasana solvent sy ny fotoana hanaovana ny fanadiovana santionany.
2. Ny vokatra kendrena dia mipoitra amin'ny tendrony maranitra, izay mampihena ny habetsaky ny ampahany voaangona ary noho izany dia manamora ny etona mihodina manaraka ary mamonjy fotoana.
3. Ny vokatra voaangona dia ao anaty methanol izay mora etona, ka mihena ny fotoana fanamainana.
Ho fehin-kevitra, ho an'ny fanadiovana ny santionany izay tena polar na hydrophilic be, ny cartridges tselatra SepaFlash C18AQ RP mitambatra amin'ny rafitra chromatography flash fanomanana SepaBean ™ Machine dia afaka manolotra vahaolana haingana sy mahomby.
Momba ny cartridges flash SepaFlash Bonded Series C18 RP
Misy andian-tsarimihetsika tselatra SepaFlash C18AQ RP miaraka amin'ny mari-pamantarana samihafa avy amin'ny Santai Technology (araka ny aseho amin'ny tabilao 2).
| Laharan'ny entana | Haben'ny tsanganana | Taham-pidirana (mL/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabilao 2. SepaFlash C18AQ RP flash cartridges.
Fitaovana famonosana: silika mifatotra C18(AQ) avo lenta, 20 - 45 μm, 100 Å.
lozisialy (araka ny aseho amin'ny tabilao 2).
Fotoana fandefasana: Aug-27-2018