Rui Huangs, Bo Sju
Lietojumprogrammu pētniecības un attīstības centrs
Ievads
Peptīds ir savienojums, kas sastāv no aminoskābēm, no kurām katrai ir unikālas fizikālās un ķīmiskās īpašības, jo aminoskābju atlikumi ir dažādi veidi un secība, kas veido tā secību.Attīstoties cietās fāzes ķīmiskajai sintēzei, dažādu aktīvo peptīdu ķīmiskā sintēze ir panākusi lielu progresu.Tomēr cietās fāzes sintēzes rezultātā iegūtā peptīda sarežģītā sastāva dēļ galaprodukts ir jāattīra ar uzticamām atdalīšanas metodēm.Parasti izmantotās peptīdu attīrīšanas metodes ietver jonu apmaiņas hromatogrāfiju (IEC) un apgrieztās fāzes augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfiju (RP-HPLC), kuru trūkumi ir zema parauga iekraušanas jauda, augstās atdalīšanas vides izmaksas, sarežģītas un dārgas atdalīšanas iekārtas, u.c. Mazu molekulu peptīdu (MW < 1 kDa) ātrai attīrīšanai Santai Technologies iepriekš publicēja veiksmīgu pielietojuma gadījumu, kurā SepaFlash RP C18 kasetne tika izmantota ātrai timopentīna (TP-5) un tika iegūts prasībām atbilstošs mērķa produkts.
1. attēls. 20 izplatītas aminoskābes (atveidots no www.bachem.com).
Ir 20 veidu aminoskābes, kas ir izplatītas peptīdu sastāvā.Šīs aminoskābes var iedalīt šādās grupās pēc to polaritātes un skābes-bāzes īpašībām: nepolāras (hidrofobiskas), polāras (neuzlādētas), skābas vai bāziskas (kā parādīts 1. attēlā).Ja peptīdu secībā aminoskābes, kas veido secību, lielākoties ir polāras (kā 1. attēlā atzīmētas rozā krāsā), piemēram, cisteīns, glutamīns, asparagīns, serīns, treonīns, tirozīns utt., tad šim peptīdam var būt spēcīga polaritāte un labi šķīst ūdenī.Šo spēcīgo polāro peptīdu paraugu attīrīšanas procedūras laikā ar apgrieztās fāzes hromatogrāfiju notiks parādība, ko sauc par hidrofobās fāzes sabrukumu (skatiet iepriekš publicēto Santai Technologies piezīmi par pieteikumu: Hidrofobās fāzes sabrukums, AQ apgrieztās fāzes hromatogrāfijas kolonnas un to pielietojumi).Salīdzinot ar parastajām C18 kolonnām, uzlabotās C18AQ kolonnas ir vispiemērotākās spēcīgu polāru vai hidrofilu paraugu attīrīšanai.Šajā amatā kā paraugs tika izmantots spēcīgs polārs peptīds un attīrīts ar C18AQ kolonnu.Rezultātā tika iegūts prasībām atbilstošs mērķa produkts, ko varēja izmantot turpmākajos pētījumos un attīstībā.
| Instruments | SepaBean™mašīna 2 | |||
| Kasetnes | 12 g SepaFlash C18 RP zibspuldzes kasetne (sfērisks silīcija dioksīds, 20–45 μm, 100 Å, Pasūtījuma numurs: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP zibspuldzes kasetne (sfērisks silīcija dioksīds, 20–45 μm, 100 Å, Pasūtījuma numurs: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| Viļņa garums | 254 nm, 220 nm | 214 nm | ||
| Mobilā fāze | Šķīdinātājs A: ūdens Šķīdinātājs B: acetonitrils | |||
| Plūsmas ātrums | 15 ml/min | 20 ml/min | ||
| Parauga ielāde | 30 mg | |||
| Gradients | Laiks (CV) | Šķīdinātājs B (%) | Laiks (min) | Šķīdinātājs B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
Rezultāti un diskusija
Lai salīdzinātu polārā peptīda parauga attīrīšanas veiktspēju starp parasto C18 kolonnu un C18AQ kolonnu, mēs izmantojām parasto C18 kolonnu parauga ātrai attīrīšanai.Kā parādīts 2. attēlā, C18 ķēžu hidrofobās fāzes sabrukuma dēļ, ko izraisīja augsta ūdens attiecība, paraugs tik tikko saglabājās parastajā C18 kārtridžā un tika tieši eluēts ar kustīgo fāzi.Rezultātā paraugs netika efektīvi atdalīts un attīrīts.
2. attēls. Parauga zibspuldzes hromatogramma uz parastās C18 kasetnes.
Pēc tam mēs izmantojām C18AQ kolonnu parauga ātrai attīrīšanai.Kā parādīts 3. attēlā, peptīds tika efektīvi noturēts uz kolonnas un pēc tam eluēts.Mērķa produkts tika atdalīts no piemaisījumiem neapstrādātā paraugā un savākts.Pēc liofilizācijas un pēc tam analizētas ar HPLC, attīrītā produkta tīrība ir 98,2%, un to var tālāk izmantot nākamajā pētniecībā un attīstībā.
3. attēls. C18AQ kasetnes parauga zibspuldzes hromatogramma.
Visbeidzot, SepaFlash C18AQ RP zibspuldzes kasetne apvienojumā ar zibspuldzes hromatogrāfijas sistēmu SepaBean™iekārta varētu piedāvāt ātru un efektīvu risinājumu spēcīgu polāru vai hidrofilu paraugu attīrīšanai.
Ir vairākas SepaFlash C18AQ RP zibspuldzes kasetnes ar dažādām Santai Technology specifikācijām (kā parādīts 2. tabulā).
| Lietas numurs | Kolonnas izmērs | Plūsmas ātrums (ml/min) | Maksimālais spiediens (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
2. tabula. SepaFlash C18AQ RP zibspuldzes kasetnes.Iepakojuma materiāli: Augstas efektivitātes sfērisks C18(AQ) silīcija dioksīds, 20 - 45 μm, 100 Å.
Lai iegūtu papildinformāciju par detalizētām SepaBean™ iekārtas specifikācijām vai SepaFlash sērijas zibspuldzes kasetņu pasūtīšanas informāciju, lūdzu, apmeklējiet mūsu vietni.
Publicēšanas laiks: 12.10.2018