Hongcheng Wang, Bo Xu
Pieteikuma pētniecības un attīstības centrs
Ievads
Saskaņā ar stacionārās fāzes un mobilās fāzes relatīvajām polaritātēm šķidruma hromatogrāfiju var iedalīt normālā hromatogrāfijā (NPC) un apgrieztās fāzes hromatogrāfijā (RPC). RPC mobilās fāzes polaritāte ir spēcīgāka nekā stacionārajā fāzē. RPC ir kļuvis par visplašāk izmantoto šķidruma hromatogrāfijas atdalīšanas režīmos, pateicoties tā augstajai efektivitātei, labai izšķirtspējai un skaidrai aiztures mehānismam. Tāpēc RPC ir piemērots dažādu polāro vai nepolāro savienojumu, ieskaitot alkaloīdus, ogļhidrātu, taukskābju, steroīdu, nukleīnskābju, aminoskābju, peptīdu, olbaltumvielu, proteīnu utt. RPC atdalīšanai un attīrīšanai. Ciāno, amino utt. Starp šīm saistītajām funkcionālajām grupām visplašāk izmantotā ir C18. Tiek lēsts, ka vairāk nekā 80% RPC tagad izmanto C18 saistīto fāzi. Tāpēc C18 hromatogrāfijas kolonna ir kļuvusi par obligātu universālu kolonnu katrai laboratorijai.
Lai arī C18 kolonnu var izmantot ļoti plašā lietojumprogrammu diapazonā, dažiem paraugiem, kas ir ļoti polāri vai ļoti hidrofīli, regulārām C18 kolonnām var būt problēmas, ja tās tiek izmantotas šādu paraugu attīrīšanai. RPC parasti izmantotos eluācijas šķīdinātājus var pasūtīt atbilstoši to polaritātei: ūdens <metanols <acetonitrils <etanols <tetrahidrofurāns <izopropanols. Lai nodrošinātu labu kolonnas saglabāšanu šiem paraugiem (spēcīgi polārie vai ļoti hidrofīlie), kā mobilajai fāzei ir jāizmanto liela ūdens sistēmas īpatsvars. Tomēr, kad kā mobilo fāzi tiek izmantotas tīra ūdens sistēma (ieskaitot tīru ūdeni vai tīru sāls šķīdumu), garā oglekļa ķēde C18 kolonnas stacionārajā fāzē mēdz izvairīties no ūdens un sajaukt savā starpā, kā rezultātā tiek uzreiz samazināta kolonnas aiztures spēja vai pat bez aiztures. Šo parādību sauc par “hidrofobās fāzes sabrukumu” (kā parādīts 1. attēla kreisajā daļā). Lai arī šī situācija ir atgriezeniska, ja kolonnu mazgā ar organiskiem šķīdinātājiem, piemēram, metanolu vai acetonitrilu, tā joprojām var izraisīt kolonnas bojājumus. Tāpēc ir jānovērš šī situācija.
1. attēls. Saistīto fāžu shematiskā diagramma uz silikagela virsmas regulārajā C18 kolonnā (pa kreisi) un C18Aq kolonnā (pa labi).
Lai risinātu iepriekšminētās problēmas, hromatogrāfijas iepakojuma materiālu ražotāji ir veikuši tehniskus uzlabojumus. Viens no šiem uzlabojumiem ir veikt dažas modifikācijas uz silīcija dioksīda matricas virsmas, piemēram, hidrofilo ciano grupu ieviešanu (kā parādīts 1. attēla labajā daļā), lai padarītu silikagela virsmu hidrofiliskāku. Tādējādi C18 ķēdes uz silīcija dioksīda virsmas varētu pilnībā paplašināt augstos ūdens apstākļos, un varētu izvairīties no hidrofobās fāzes sabrukšanas. Šīs modificētās C18 kolonnas sauc par C18 ūdens kolonnām, proti, C18AQ kolonnām, kuras ir paredzētas augsti ūdens eluēšanas apstākļiem un var paciest 100% ūdens sistēmu. C18AQ kolonnas ir plaši izmantotas spēcīgu polāro savienojumu atdalīšanā un attīrīšanā, ieskaitot organiskās skābes, peptīdus, nukleozīdus un ūdeni šķīstošos vitamīnus.
Izalgošana ir viens no tipiskajiem C18AQ kolonnu pielietojumiem zibspuldzes attīrīšanā paraugos, kas parauga šķīdinātāja noņem sāls vai bufera komponentus, lai atvieglotu parauga pielietojumu turpmākajos pētījumos. Šajā amatā kā paraugu tika izmantots spoži zilais FCF ar spēcīgu polaritāti un attīrīts C18AQ kolonnā. Parauga šķīdinātājs tika aizstāts ar organisko šķīdinātāju no bufera šķīduma, tādējādi atvieglojot šādu rotācijas iztvaikošanu, kā arī ietaupot šķīdinātājus un darbības laiku. Turklāt parauga tīrība tika uzlabota, noņemot dažus piemaisījumus paraugā.
Eksperimentālā sadaļa
2. attēls. Parauga ķīmiskā struktūra.
Šajā amatā par paraugu tika izmantots izcili zilais FCF. Neapstrādāta parauga tīrība bija 86%, un parauga ķīmiskā struktūra tika parādīta 2. attēlā. Lai sagatavotu parauga šķīdumu, 300 mg pulverveida neapstrādāta cietā viela no spoži zilas FCF tika izšķīdināta 1 m Nah2po4 buferšķīdumā un labi satricināja, lai kļūtu par pilnīgi dzidru šķīdumu. Pēc tam parauga šķīdumu inžektors ievadīja zibspuldzē. Zibspuldzes attīrīšanas eksperimentālā iestatīšana ir uzskaitīta 1. tabulā.
| Instruments | Sepabean ™ mašīna2 | |||
| Patronas | 12 g Sepaflash C18 RP Flash kārtridža (sfēriskais silīcija dioksīds, 20-45 μm, 100 Å, pasūtījuma numurs: SW-5222-012-Sp) | 12 g Sepafash C18AQ RP Flash kārtridža (sfēriska silīcija dioksīds, 20-45 μm, 100 Å, pasūtījuma numurs ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Viļņa garums | 254 nm | |||
| Mobilā fāze | Šķīdinātājs A ： Ūdens Šķīdinātājs B ： metanols | |||
| Plūsmas ātrums | 30 ml/min | |||
| Parauga slodze | 300 mg (izcili zils FCF ar tīrību 86%) | |||
| Gradients | Laiks (CV) | B šķīdinātājs (%) | Laiks (CV) | B šķīdinātājs (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultāti un diskusija
Parauga atsāļošanai un attīrīšanai tika izmantota SepaFlah C18Aq RP zibatmiņas kasetne. Tika izmantots pakāpju gradients, kurā eluācijas sākumā kā mobilo fāzi tika izmantots tīrs ūdens un palaiž 10 kolonnu apjomus (CV). Kā parādīts 3. attēlā, kad kā mobilo fāzi izmantojat tīru ūdeni, paraugs tika pilnībā saglabāts uz zibspuldzes kasetnes. Pēc tam metanols mobilajā fāzē tika tieši palielināts līdz 100%, un gradients tika uzturēts par 7,5 cv. Paraugu eluēja no 11,5 līdz 13,5 cv. Apkopotajās frakcijās parauga šķīdums tika aizstāts no NAH2PO4 buferšķīduma līdz metanolam. Salīdzinot ar ļoti ūdens šķīdumu, metanolu nākamajā posmā bija daudz vieglāk noņemt ar rotācijas iztvaikošanu, kas atvieglo šādus pētījumus.
3. attēls. Parauga zibspuldzes hromatogramma uz C18AQ kārtridža.
Lai salīdzinātu C18AQ kārtridža un parasto C18 kārtridža saglabāšanas izturēšanos spēcīgas polaritātes paraugiem, tika veikts paralēlais salīdzināšanas tests. Tika izmantota Sepafash C18 RP zibspuldzes kasetne, un parauga zibspuldzes hromatogramma tika parādīta 4. attēlā. Regulārām C18 kārtridžiem visaugstākā panesamā ūdens fāzes attiecība ir aptuveni 90%. Tāpēc starta gradients tika iestatīts uz 10% metanola 90% ūdenī. Kā parādīts 4. attēlā, C18 ķēžu hidrofobās fāzes sabrukšanas dēļ, ko izraisa augsta ūdens attiecība, paraugu tik tikko saglabāja uz parastās C18 kārtridža un tika tieši eluēta ar mobilo fāzi. Rezultātā parauga atsāļošanas vai attīrīšanas darbību nevar pabeigt.
4. attēls. Parauga zibspuldzes hromatogramma uz parastās C18 kārtridža.
Salīdzinot ar lineāro gradientu, pakāpju gradienta izmantošanai ir šādas priekšrocības:
1. Šķīdinātāja izmantošana un darbības laiks paraugu attīrīšanai tiek samazināts.
2. Mērķa produkts elutē asā virsotnē, kas samazina savāktu frakciju apjomu un tādējādi atvieglo šādu rotācijas iztvaikošanu, kā arī ietaupot laiku.
3. Apkopotais produkts ir metanolā, kuru ir viegli iztvaikot, tādējādi tiek samazināts žāvēšanas laiks.
Noslēgumā jāsaka, ka parauga attīrīšanai, kas ir izteikti polārā vai ļoti hidrofīla, SepaFlah C18Aq Rp Flash kārtridži, kas apvienoti ar preparatīvo zibspuldzes hromatogrāfijas sistēmas Sepabean ™ mašīnu varētu piedāvāt ātru un efektīvu risinājumu.
Par Sepaflash saistītās sērijas C18 RP Flash kārtridžiem
Ir virkne Sepaflah C18AQ RP Flash kārtridžu ar atšķirīgām specifikācijām no Santai tehnoloģijas (kā parādīts 2. tabulā).
| Vienuma numurs | Kolonnas izmērs | Plūsmas ātrums (ml/min) | Max.pressure (PSI/josla) |
| SW-5222-004-Sp (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-Sp (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-Sp (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-Sp (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-Sp (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-Sp (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-Sp (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
2. tabula. SEPAFLASH C18AQ RP Flash kārtridži.
Iepakojuma materiāli: augstas efektivitātes sfēriska C18 (AQ) silīcija dioksīds, 20-45 μm, 100 Å.
Logy (kā parādīts 2. tabulā).
Pasta laiks: 27.-2018. Augusts