Hunčens Vans, Bo Sju
Lietojumprogrammu pētniecības un attīstības centrs
Ievads
Saskaņā ar stacionārās fāzes un mobilās fāzes relatīvajām polaritātēm šķidruma hromatogrāfiju var iedalīt normālās fāzes hromatogrāfijā (NPC) un apgrieztās fāzes hromatogrāfijā (RPC).RPC mobilās fāzes polaritāte ir spēcīgāka nekā stacionārajai fāzei.RPC ir kļuvis par visplašāk izmantoto šķidrumu hromatogrāfijas atdalīšanas režīmos, pateicoties tā augstajai efektivitātei, labajai izšķirtspējai un skaidram aiztures mehānismam.Tāpēc RPC ir piemērots dažādu polāru vai nepolāru savienojumu, tostarp alkaloīdu, ogļhidrātu, taukskābju, steroīdu, nukleīnskābju, aminoskābju, peptīdu, proteīnu uc atdalīšanai un attīrīšanai. RPC visbiežāk izmantotā stacionārā fāze ir silikagela matrica, kas ir saistīta ar dažādām funkcionālajām grupām, tostarp C18, C8, C4, fenilgrupu, ciāngrupu, aminogrupu utt. No šīm saistītajām funkcionālajām grupām visplašāk izmantotā ir C18.Tiek lēsts, ka vairāk nekā 80% RPC tagad izmanto C18 savienoto fāzi.Tāpēc C18 hromatogrāfijas kolonna ir kļuvusi par obligātu universālu kolonnu katrā laboratorijā.
Lai gan C18 kolonnu var izmantot ļoti plašā lietojumu klāstā, tomēr dažiem paraugiem, kas ir ļoti polāri vai ļoti hidrofili, parastajām C18 kolonnām var rasties problēmas, ja tās izmanto šādu paraugu attīrīšanai.RPC parasti izmantotos eluēšanas šķīdinātājus var sakārtot pēc to polaritātes: ūdens < metanols < acetonitrils < etanols < tetrahidrofurāns < izopropanols.Lai nodrošinātu labu šo paraugu aizturi kolonnā (spēcīgi polāri vai ļoti hidrofili), kā kustīgā fāze ir jāizmanto liela ūdens sistēmas daļa.Tomēr, ja kā kustīgo fāzi izmanto tīra ūdens sistēmu (tostarp tīru ūdeni vai tīru sāls šķīdumu), garajai oglekļa ķēdei C18 kolonnas stacionārajā fāzē ir tendence izvairīties no ūdens un sajaukties savā starpā, kā rezultātā momentāni samazinās kolonnas aiztures spēja vai pat bez aiztures.Šo parādību sauc par "hidrofobās fāzes sabrukumu" (kā parādīts 1. attēla kreisajā daļā).Lai gan šī situācija ir atgriezeniska, ja kolonnu mazgā ar organiskiem šķīdinātājiem, piemēram, metanolu vai acetonitrilu, tā joprojām var sabojāt kolonnu.Tāpēc ir nepieciešams novērst šādas situācijas rašanos.
1. attēls. Saistīto fāžu shematiskā diagramma uz silikagela virsmas parastajā C18 kolonnā (pa kreisi) un C18AQ kolonnā (pa labi).
Lai risinātu iepriekš minētās problēmas, hromatogrāfisko iepakojuma materiālu ražotāji ir veikuši tehniskus uzlabojumus.Viens no šiem uzlabojumiem ir dažu modifikāciju veikšana silīcija dioksīda matricas virsmā, piemēram, hidrofilu ciāngrupu ieviešana (kā parādīts 1. attēla labajā pusē), lai padarītu silikagēla virsmu hidrofilāku.Tādējādi C18 ķēdes uz silīcija dioksīda virsmas varēja pilnībā pagarināt ļoti ūdens apstākļos, un varēja izvairīties no hidrofobās fāzes sabrukšanas.Šīs modificētās C18 kolonnas sauc par ūdens C18 kolonnām, proti, C18AQ kolonnām, kuras ir paredzētas ļoti ūdens eluēšanas apstākļiem un var izturēt 100% ūdens sistēmu.C18AQ kolonnas ir plaši izmantotas spēcīgu polāru savienojumu, tostarp organisko skābju, peptīdu, nukleozīdu un ūdenī šķīstošo vitamīnu, atdalīšanai un attīrīšanai.
Atsāļošana ir viens no tipiskiem C18AQ kolonnu pielietojumiem paraugu zibens attīrīšanā, kas noņem sāli vai bufera komponentus parauga šķīdinātājā, lai atvieglotu parauga lietošanu turpmākajos pētījumos.Šajā ziņojumā kā paraugs tika izmantots Brilliant Blue FCF ar spēcīgu polaritāti un attīrīts C18AQ kolonnā.Parauga šķīdinātājs tika aizstāts ar organisko šķīdinātāju no buferšķīduma, tādējādi veicinot sekojošo rotācijas iztvaikošanu, kā arī ietaupot šķīdinātājus un darbības laiku.Turklāt parauga tīrība tika uzlabota, noņemot dažus piemaisījumus paraugā.
Eksperimentālā sadaļa
2. attēls. Parauga ķīmiskā struktūra.
Šajā ziņojumā kā paraugs tika izmantots Brilliant Blue FCF.Neapstrādātā parauga tīrība bija 86%, un parauga ķīmiskā struktūra ir parādīta 2. attēlā. Lai sagatavotu parauga šķīdumu, 300 mg pulverveida briljantzilā FCF neapstrādātas cietvielas izšķīdināja 1 M NaH2PO4 buferšķīdumā un labi sakrata, lai iegūtu pilnīgi skaidrs risinājums.Pēc tam parauga šķīdums tika ievadīts zibspuldzes kolonnā ar inžektoru.Zibspuldzes attīrīšanas eksperimentālā iestatīšana ir norādīta 1. tabulā.
| Instruments | SepaBean™ mašīna2 | |||
| Kasetnes | 12 g SepaFlash C18 RP zibspuldzes kasetne (sfērisks silīcija dioksīds, 20–45 μm, 100 Å, Pasūtījuma numurs: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP zibspuldzes kasetne (sfērisks silīcija dioksīds, 20–45 μm, 100 Å, Pasūtījuma numurs: SW-5222-012-SP(AQ))) | ||
| Viļņa garums | 254 nm | |||
| Mobilā fāze | Šķīdinātājs A: ūdens Šķīdinātājs B: metanols | |||
| Plūsmas ātrums | 30 ml/min | |||
| Parauga ielāde | 300 mg (Brilliant Blue FCF ar tīrību 86%) | |||
| Gradients | Laiks (CV) | Šķīdinātājs B (%) | Laiks (CV) | Šķīdinātājs B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultāti un diskusija
Paraugu atsāļošanai un attīrīšanai tika izmantota SepaFlash C18AQ RP zibspuldzes kasetne.Tika izmantots pakāpju gradients, kurā kā kustīgā fāze eluēšanas sākumā tika izmantots tīrs ūdens un tika palaists 10 kolonnas tilpumos (CV).Kā parādīts 3. attēlā, izmantojot tīru ūdeni kā kustīgo fāzi, paraugs pilnībā palika uz zibspuldzes kasetnes.Pēc tam metanols mobilajā fāzē tika tieši palielināts līdz 100%, un gradients tika saglabāts 7, 5 CV.Paraugs tika eluēts no 11,5 līdz 13,5 CV.Savāktajās frakcijās parauga šķīdums tika aizstāts no NaH2PO4 buferšķīduma ar metanolu.Salīdzinot ar ļoti ūdens šķīdumu, nākamajā posmā metanolu bija daudz vieglāk noņemt ar rotācijas iztvaicēšanu, kas atvieglo turpmāko izpēti.
3. attēls. C18AQ kasetnes parauga zibspuldzes hromatogramma.
Lai salīdzinātu C18AQ kasetnes un parastās C18 kasetnes aiztures īpašības spēcīgas polaritātes paraugiem, tika veikts paralēlais salīdzināšanas tests.Tika izmantota SepaFlash C18 RP zibspuldzes kasetne, un parauga zibspuldzes hromatogramma ir parādīta 4. attēlā. Parastajām C18 kārtridžām augstākā pieļaujamā ūdens fāzes attiecība ir aptuveni 90%.Tāpēc sākuma gradients tika iestatīts uz 10% metanola 90% ūdenī.Kā parādīts 4. attēlā, C18 ķēžu hidrofobās fāzes sabrukuma dēļ, ko izraisīja augsta ūdens attiecība, paraugs tik tikko saglabājās parastajā C18 kārtridžā un tika tieši eluēts ar kustīgo fāzi.Tā rezultātā nevar pabeigt parauga atsālīšanas vai attīrīšanas darbību.
4. attēls. Parauga zibspuldzes hromatogramma uz parastās C18 kasetnes.
Salīdzinot ar lineāro gradientu, soļu gradienta izmantošanai ir šādas priekšrocības:
1. Tiek samazināts šķīdinātāja lietojums un darbības laiks parauga attīrīšanai.
2. Mērķa produkts eluē asā pīķā, kas samazina savākto frakciju tilpumu un tādējādi atvieglo sekojošo rotācijas iztvaikošanu, kā arī ietaupa laiku.
3. Savāktais produkts atrodas metanolā, kas viegli iztvaicē, tādējādi tiek samazināts žūšanas laiks.
Noslēgumā jāsaka, ka stipri polāra vai ļoti hidrofila parauga attīrīšanai SepaFlash C18AQ RP zibspuldzes kasetnes apvienojumā ar preparatīvo zibspuldzes hromatogrāfijas sistēmu SepaBean™ Machine varētu piedāvāt ātru un efektīvu risinājumu.
Par SepaFlash Bonded Series C18 RP zibspuldzes kasetnēm
Ir vairākas SepaFlash C18AQ RP zibspuldzes kasetnes ar dažādām Santai Technology specifikācijām (kā parādīts 2. tabulā).
| Lietas numurs | Kolonnas izmērs | Plūsmas ātrums (ml/min) | Maksimālais spiediens (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
2. tabula. SepaFlash C18AQ RP zibspuldzes kasetnes.
Iepakojuma materiāli: Augstas efektivitātes sfērisks C18(AQ) silīcija dioksīds, 20 - 45 μm, 100 Å.
loģika (kā parādīts 2. tabulā).
Ievietošanas laiks: 27-2018 augusts