Hongchengas Wangas, Bo Xu
Taikymo tyrimų ir plėtros centras
Įvadas
Remiantis stacionarios ir mobiliosios fazės santykiniuose poliškumuose, skysčių chromatografiją galima suskirstyti į normalią fazės chromatografiją (NPC) ir atvirkštinę fazės chromatografiją (RPC). RPC mobiliosios fazės poliškumas yra stipresnis nei nejudančios fazės. Dėl didelio efektyvumo, geros skiriamosios gebos ir aiškaus sulaikymo mechanizmo RPC tapo plačiausiai naudojamu skysčių chromatografijos atskyrimo režimais. Todėl RPC yra tinkamas įvairių polinių ar nepolinių junginių atskyrimui ir valymui, įskaitant alkaloidus, angliavandenius, riebalų rūgštis, steroidus, nukleorūgštis, amino rūgštis, peptidus, baltymus ir kt. Cyano, amino ir kt. Tarp šių surištų funkcinių grupių plačiausiai naudojama C18. Manoma, kad daugiau nei 80% RPC dabar naudoja C18 sujungtą fazę. Todėl C18 chromatografijos stulpelis tapo būtinu universalia kolonėle kiekvienoje laboratorijoje.
Nors C18 stulpelis gali būti naudojamas labai plačiai, tačiau kai kuriems mėginiams, kurie yra labai poliniai ar labai hidrofiliniai, reguliarūs C18 kolonėlės gali kilti problemų, kai naudojami tokiems mėginiams išvalyti. RPC dažniausiai naudojami eliuavimo tirpikliai gali būti užsakomi pagal jų poliškumą: vanduo <metanolis <acetonitrilas <etanolis <tetrahidrofuran <izopropanolio. Norint užtikrinti gerą šių mėginių kolonėlės sulaikymą (stiprią poliarinį ar labai hidrofilinį), reikia didelę vandeninės sistemos dalį naudoti kaip mobiliąja faze. Tačiau kai naudojama gryna vandens sistema (įskaitant gryną vandenį ar gryną druskos tirpalą) kaip mobilią fazę, ilgos anglies grandinė nejudančioje C18 kolonėlės fazėje linkusi išvengti vandens ir maišyti tarpusavyje, todėl akimirksniu sumažėja kolonos sulaikymo talpa ar net nesulaikymas. Šis reiškinys vadinamas „hidrofobine fazės griūtimi“ (kaip parodyta kairėje 1 paveikslo dalyje). Nors ši situacija yra grįžtama, kai kolona plaunama organiniais tirpikliais, tokiais kaip metanolio ar acetonitrilo, ji vis tiek gali pažeisti koloną. Todėl būtina užkirsti kelią šiai situacijai.
1 paveikslas. Siūlomos fazių schemos schemos schema įprastoje C18 kolonėlėje (kairėje) ir C18AQ stulpelyje (dešinėje).
Norėdami išspręsti aukščiau paminėtas problemas, chromatografinės pakavimo medžiagų gamintojai padarė techninius patobulinimus. Vienas iš šių patobulinimų yra tam tikrų modifikacijų ant silicio dioksido matricos paviršiaus, pavyzdžiui, hidrofilinių ciano grupių įvedimas (kaip parodyta dešinėje 1 paveikslo dalyje), kad silikagelio paviršius taptų hidrofiliniu. Taigi C18 grandinės ant silicio dioksido paviršiaus gali būti visiškai išplėstos labai vandeninėmis sąlygomis, ir buvo galima išvengti hidrofobinės fazės griūties. Šios modifikuotos C18 stulpeliai vadinami vandeniniais C18 kolonėlėmis, būtent C18AQ stulpeliais, kurie yra skirti labai vandeniniam eliuavimo sąlygoms ir gali toleruoti 100% vandeninę sistemą. C18AQ kolonos buvo plačiai pritaikytos atskyrus ir valant stiprius polinius junginius, įskaitant organines rūgštis, peptidus, nukleozidus ir vandenyje tirpius vitaminus.
Pretendavimas yra vienas iš tipiškų C18AQ kolonų pritaikymo pavyzdžių blykstės gryninimui, kuris pašalina druskos ar buferinius komponentus mėginio tirpiklyje, kad būtų lengviau panaudoti mėginį vėlesniuose tyrimuose. Šiame įraše kaip mėginys buvo naudojamas ryškiai mėlyna FCF su stipru poliškumu ir išgrynintas C18AQ stulpelyje. Mėginio tirpiklis buvo pakeistas organiniu tirpikliu iš buferinio tirpalo, taip palengvinant šį sukamąjį išgarinimą, taip pat taupant tirpiklius ir eksploatavimo laiką. Be to, mėginio grynumas buvo pagerintas pašalinus kai kurias imties priemaišas.
Eksperimentinis skyrius
2 paveikslas. Mėginio cheminė struktūra.
Šiame įraše kaip pavyzdys buvo naudojamas ryškiai mėlyna FCF. Neapdoroto mėginio grynumas buvo 86%, o mėginio cheminė struktūra buvo parodyta 2 paveiksle. Norint paruošti mėginio tirpalą, 300 mg miltelių pavidalo kietos medžiagos, esančios ryškiai mėlynos spalvos FCF, buvo ištirpinta 1 M NAH2PO4 buferio tirpale ir gerai sukrėtė, kad taptų visiškai aiškiu sprendimu. Tada mėginio tirpalą į „Flash“ stulpelį įšvirkščiamas injektorius. Eksperimentinė blykstės gryninimo sąranka išvardyta 1 lentelėje.
| Instrumentas | „Sepabean ™“ mašina2 | |||
| Kasetės | 12 g „Sepaflash C18 RP“ blykstės kasetė (sferinis silicio dioksidas, 20-45 μm, 100 Å, užsakymo numeris: SW-5222-012-SP) | 12 g „Sepaflash C18AQ RP“ blykstės kasetė (sferinis silicio dioksidas, 20-45 μm, 100 Å, užsakymo numeris ： SW-5222-012-SP (aq)） | ||
| Bangos ilgis | 254 nm | |||
| Mobilioji fazė | Tirpiklis A ： Vanduo Tirpiklis B ： Metanolis | |||
| Srauto greitis | 30 ml/min | |||
| Mėginio pakrovimas | 300 mg (ryškiai mėlyna FCF, kurio grynumas yra 86%) | |||
| Gradientas | Laikas (CV) | Tirpiklis B (%) | Laikas (CV) | Tirpiklis B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultatai ir diskusija
Mėginiui išsiveržti ir valyti buvo naudojama „Sepaflash C18AQ RP“ flash kasetė. Buvo naudojamas žingsnio gradientas, kuriame grynas vanduo buvo naudojamas kaip mobilioji fazė eliuavimo pradžioje ir paleisti 10 stulpelių tūrio (CV). Kaip parodyta 3 paveiksle, kai naudojama grynu vandeniu kaip mobiliąja faze, mėginys buvo visiškai išlaikytas ant blykstės kasetės. Toliau mobiliosios fazės metanolis buvo tiesiogiai padidintas iki 100%, o gradientas buvo palaikomas 7,5 cv. Mėginys buvo išplaunamas nuo 11,5 iki 13,5 cv. Surinktose frakcijose mėginio tirpalas buvo pakeistas iš NAH2PO4 buferio tirpalo į metanolį. Palyginus su labai vandeniniu tirpalu, metanolį buvo daug lengviau pašalinti pasukus rotacinį išgarinimą kitame etape, kuris palengvina šiuos tyrimus.
3 paveikslas. Mėginio blykstės chromatograma ant C18AQ kasetės.
Norėdami palyginti C18AQ kasetės ir įprastos C18 kasetės sulaikymo elgseną, kad būtų galima mėgti stiprų poliškumą, buvo atliktas lygiagretus palyginimo testas. Buvo naudojama „Sepaflash C18 RP“ blykstės kasetė, o mėginio blykstės chromatograma parodyta 4 paveiksle. Reguliarioms C18 kasetėms aukščiausias toleruojamas vandeninės fazės santykis yra apie 90%. Todėl 90% vandens pradžios gradientas buvo 10% metanolio. Kaip parodyta 4 paveiksle, dėl C18 grandinių hidrofobinės fazės žlugimo, kurį sukelia didelis vandeninis santykis, mėginys buvo vos išlaikytas įprastoje C18 kasetėje ir buvo tiesiogiai išplauta mobilioji fazė. Dėl to negalima atlikti mėginio pražūtingo ar gryninimo veikimo.
4 paveikslas. Mėginio blykstės chromatograma ant įprastos C18 kasetės.
Palyginus su linijiniu gradientu, žingsnių gradiento naudojimas turi šiuos pranašumus:
1. Sumažintas tirpiklio naudojimas ir paleidimo laikas, skirtas valyti mėginius.
2. Tikslinis produktas išaugo aštrioje smailėje, o tai sumažina surinktų frakcijų tūrį ir taip palengvina šį sukamojo išgarinimą, taip pat taupymo laiką.
3. Surinktas produktas yra metanolyje, kurį lengva išgaruoti, todėl sumažėja džiovinimo laikas.
Apibendrinant galima pasakyti, kad norint išvalyti mėginį, kuris yra stipriai polinis ar labai hidrofilinis, „Sepaflash C18aq RP“ flash kasetės, derinant su paruošiamu blykstės chromatografijos sistemos „Sepabean ™“ aparate, galėtų pasiūlyti greitą ir efektyvų sprendimą.
Apie „Sepaflash“ surištą seriją C18 RP „Flash“ kasetės
Yra daugybė „Sepaflash C18AQ RP“ blykstės kasečių, turinčių skirtingas „Santai“ technologijos specifikacijas (kaip parodyta 2 lentelėje).
| Prekės numeris | Stulpelio dydis | Srauto greitis (ml/min) | MAX.PRESSURE (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (aq) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP (aq) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP (aq) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30–60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40–80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40–80 | 250/17.2 |
2 lentelė. „Sepaflash C18aq RP“ blykstės kasetės.
Pakavimo medžiagos: Didelio efektyvumo sferinė C18 (AQ) silicio dioksidas, 20-45 μm, 100 Å.
LOGY (kaip parodyta 2 lentelėje).
Pašto laikas: 2018 m. Rugpjūčio 27 d