Hongcheng Wang, Bo Xu
Taikymo tyrimų ir plėtros centras
Įvadas
Pagal santykinį stacionarios ir judriosios fazės poliškumą skysčių chromatografija gali būti skirstoma į normaliosios fazės chromatografiją (NPC) ir atvirkštinės fazės chromatografiją (RPC).RPC atveju judriosios fazės poliškumas yra stipresnis nei stacionarios fazės.Dėl didelio efektyvumo, geros skiriamosios gebos ir aiškaus sulaikymo mechanizmo RPC tapo plačiausiai naudojamu skysčių chromatografijos atskyrimo režimuose.Todėl RPC tinka įvairių polinių ar nepolinių junginių, įskaitant alkaloidus, angliavandenius, riebalų rūgštis, steroidus, nukleino rūgštis, aminorūgštis, peptidus, baltymus ir kt., atskyrimui ir gryninimui. RPC dažniausiai naudojama stacionari fazė yra silikagelio matrica, kuri yra sujungta su įvairiomis funkcinėmis grupėmis, įskaitant C18, C8, C4, fenilą, ciano, amino ir kt. Tarp šių surištų funkcinių grupių plačiausiai naudojama C18.Apskaičiuota, kad daugiau nei 80% RPC dabar naudoja C18 surištą fazę.Todėl C18 chromatografijos kolonėlė tapo privaloma universalia kiekvienoje laboratorijoje.
Nors C18 kolonėlė gali būti naudojama labai įvairiai, tačiau kai kuriems labai poliniams arba labai hidrofiliniams mėginiams įprastos C18 kolonėlės gali turėti problemų, kai jos naudojamos tokiems mėginiams valyti.RPC dažniausiai naudojamus eliuavimo tirpiklius galima suskirstyti pagal jų poliškumą: vanduo < metanolis < acetonitrilas < etanolis < tetrahidrofuranas < izopropanolis.Norint užtikrinti gerą šių mėginių (stiprios polinės arba labai hidrofilinės) sulaikymą kolonėlėje, kaip judriąją fazę būtina naudoti didelę vandeninės sistemos dalį.Tačiau naudojant gryno vandens sistemą (įskaitant gryną vandenį arba gryną druskos tirpalą) kaip judriąją fazę, C18 kolonėlės stacionarios fazės ilgoji anglies grandinė yra linkusi vengti vandens ir maišytis viena su kita, todėl akimirksniu sumažėja kolonėlės sulaikymo geba arba net jos nėra.Šis reiškinys vadinamas „hidrofobinės fazės žlugimu“ (kaip parodyta 1 paveikslo kairėje dalyje).Nors ši situacija yra grįžtama, kai kolonėlė plaunama organiniais tirpikliais, tokiais kaip metanolis arba acetonitrilas, ji vis tiek gali sugadinti kolonėlę.Todėl būtina užkirsti kelią tokiai situacijai.
1 pav. Surištų fazių schema ant silikagelio paviršiaus įprastoje C18 kolonėlėje (kairėje) ir C18AQ kolonėlėje (dešinėje).
Siekdami išspręsti pirmiau minėtas problemas, chromatografinių pakavimo medžiagų gamintojai padarė techninius patobulinimus.Vienas iš šių patobulinimų yra kai kurie silicio dioksido matricos paviršiaus pakeitimai, pvz., hidrofilinių ciano grupių įvedimas (kaip parodyta 1 paveikslo dešinėje), kad silikagelio paviršius būtų hidrofiliškesnis.Taigi C18 grandinės ant silicio dioksido paviršiaus gali būti visiškai išplėstos esant labai vandeningoms sąlygoms ir būtų galima išvengti hidrofobinės fazės žlugimo.Šios modifikuotos C18 kolonėlės vadinamos vandeninėmis C18 kolonėlėmis, būtent C18AQ kolonėlėmis, kurios skirtos eliuavimo su dideliu vandeniniu kiekiu sąlygomis ir gali toleruoti 100 % vandeninę sistemą.C18AQ kolonėlės buvo plačiai naudojamos stiprių polinių junginių, įskaitant organines rūgštis, peptidus, nukleozidus ir vandenyje tirpius vitaminus, atskyrimui ir gryninimui.
Druskos pašalinimas yra vienas iš tipiškų C18AQ kolonėlių naudojimo būdų greitam mėginių gryninimui, kuris pašalina druską arba buferio komponentus iš mėginio tirpiklio, kad būtų lengviau pritaikyti mėginį vėlesniuose tyrimuose.Šiame įraše kaip pavyzdys buvo naudojamas Brilliant Blue FCF su stipriu poliškumu ir išgrynintas C18AQ kolonėlėje.Mėginio tirpiklis buvo pakeistas organiniu tirpikliu iš buferinio tirpalo, taip palengvinant tolesnį rotacinį išgarinimą, taip pat taupant tirpiklius ir veikimo laiką.Be to, mėginio grynumas buvo pagerintas pašalinus kai kurias mėginio priemaišas.
Eksperimentinis skyrius
2 pav. Cheminė mėginio struktūra.
Šiame įraše kaip pavyzdys buvo naudojamas Brilliant Blue FCF.Neapdoroto mėginio grynumas buvo 86%, o cheminė mėginio struktūra parodyta 2 paveiksle. Norint paruošti mėginio tirpalą, 300 mg miltelių pavidalo neapdorotos Brilliant Blue FCF kietos medžiagos buvo ištirpinta 1 M NaH2PO4 buferiniame tirpale ir gerai suplakama, kad taptų. visiškai aiškus sprendimas.Tada mėginio tirpalas purkštuvu buvo įšvirkščiamas į „flash“ kolonėlę.Eksperimentinė blykstės valymo sąranka pateikta 1 lentelėje.
| Instrumentas | SepaBean™ mašina2 | |||
| Kasetės | 12 g SepaFlash C18 RP blykstės kasetė (sferinis silicio dioksidas, 20–45 μm, 100 Å, užsakymo numeris: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP blykstės kasetė (sferinis silicio dioksidas, 20–45 μm, 100 Å, užsakymo numeris: SW-5222-012-SP (AQ))) | ||
| Bangos ilgis | 254 nm | |||
| Mobili fazė | Tirpiklis A: vanduo Tirpiklis B: metanolis | |||
| Srauto greitis | 30 ml/min | |||
| Mėginio įkėlimas | 300 mg (Brilliant Blue FCF, kurio grynumas 86%) | |||
| Gradientas | Laikas (CV) | B tirpiklis (%) | Laikas (CV) | B tirpiklis (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Rezultatai ir DISKUSIJA
Mėginių nudruskinimui ir gryninimui buvo naudojama SepaFlash C18AQ RP blykstės kasetė.Buvo naudojamas pakopinis gradientas, kuriame grynas vanduo buvo naudojamas kaip mobilioji fazė eliuavimo pradžioje ir buvo paleista 10 kolonėlės tūrių (CV).Kaip parodyta 3 paveiksle, naudojant gryną vandenį kaip mobiliąją fazę, mėginys visiškai išliko ant blykstės kasetės.Tada metanolis mobiliojoje fazėje buvo tiesiogiai padidintas iki 100%, o gradientas buvo palaikomas 7, 5 CV.Mėginys buvo išplautas nuo 11,5 iki 13,5 CV.Surinktose frakcijose mėginio tirpalas buvo pakeistas iš NaH2PO4 buferinio tirpalo į metanolį.Palyginti su labai vandeniniu tirpalu, metanolį buvo daug lengviau pašalinti rotaciniu garinimu tolesniame etape, o tai palengvina tolesnį tyrimą.
3 pav. Mėginio greitoji chromatograma ant C18AQ kasetės.
Norint palyginti C18AQ kasetės ir įprastos C18 kasetės sulaikymo elgesį stipraus poliškumo pavyzdžiams, buvo atliktas lygiagretus palyginimo testas.Naudota SepaFlash C18 RP blykstės kasetė, o mėginio chromatograma parodyta 4 paveiksle. Įprastose C18 kasetėse didžiausias toleruojamas vandeninės fazės santykis yra apie 90%.Todėl pradinis gradientas buvo nustatytas ties 10% metanolio 90% vandens.Kaip parodyta 4 paveiksle, dėl didelio vandens santykio sukelto C18 grandinių hidrofobinės fazės žlugimo, mėginys vos išliko ant įprastos C18 kasetės ir buvo tiesiogiai išplautas judriosios fazės.Dėl to mėginio nudruskinimo arba valymo operacijos negalima užbaigti.
4 pav. Mėginio greitoji chromatograma ant įprastos C18 kasetės.
Palyginti su linijiniu gradientu, žingsninio gradiento naudojimas turi šiuos privalumus:
1. Sumažėja tirpiklio naudojimas ir mėginio valymo laikas.
2. Tikslinis produktas eliuuoja staigiu smailiu, o tai sumažina surinktų frakcijų tūrį ir taip palengvina tolesnį rotacinį išgarinimą bei taupo laiką.
3. Surinktas produktas yra metanolyje, kuris lengvai išgaruoja, todėl sutrumpėja džiūvimo laikas.
Apibendrinant galima pasakyti, kad norint išvalyti labai polinį arba labai hidrofilinį mėginį, SepaFlash C18AQ RP blykstės kasetės, derinamos su preparatine greitosios chromatografijos sistema SepaBean™ Machine, gali pasiūlyti greitą ir efektyvų sprendimą.
Apie SepaFlash Bonded Series C18 RP blykstės kasetes
Yra keletas SepaFlash C18AQ RP blykstės kasečių, kurių specifikacijos skiriasi nuo Santai Technology (kaip parodyta 2 lentelėje).
| Prekės numeris | Stulpelio dydis | Srauto greitis (ml/min.) | Maksimalus slėgis (psi/baras) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17,2 |
2 lentelė. SepaFlash C18AQ RP blykstės kasetės.
Pakavimo medžiagos: didelio efektyvumo sferinis C18(AQ) surištas silicio dioksidas, 20 - 45 μm, 100 Å.
logika (kaip parodyta 2 lentelėje).
Paskelbimo laikas: 2018-08-27