Hongcheng Wang, Bo Xu
Applikatioun R&D Center
Aféierung
Geméiss de relativen Polaritéite vun der stationärer Phase an der mobiler Phase, kann d'Flëssegkeetschromatographie an normal Phase Chromatography (NPC) a Reversed Phase Chromatography (RPC) opgedeelt ginn.Fir RPC ass d'Polaritéit vun der mobiler Phase méi staark wéi déi vun der stationärer Phase.RPC ass am meeschte verbreet benotzt ginn a Flëssegchromatographie Trennungsmodi wéinst senger héijer Effizienz, gudder Opléisung a klore Retentionmechanismus.Dofir ass RPC gëeegent fir d'Trennung an d'Reinigung vu verschiddene polare oder net-polare Verbindungen, dorënner Alkaloiden, Kuelenhydrater, Fettsäuren, Steroiden, Nukleinsäuren, Aminosaieren, Peptiden, Proteinen, etc. Am RPC ass déi meescht benotzt stationär Phase d'Silikagel Matrix déi mat verschiddene funktionelle Gruppen gebonnen ass, dorënner C18, C8, C4, Phenyl, Cyano, Amino, etc.. Ënnert dëse gebonnen funktionelle Gruppen ass déi meescht benotzt C18.Et gëtt geschat datt méi wéi 80% vun RPC elo C18 gebonnen Phase benotzen.Dofir ass C18 Chromatographie Kolonn e Must-Have Universal Kolonn fir all Laboratoire ginn.
Och wann d'C18 Kolonn an enger ganz breet Palette vun Uwendungen benotzt ka ginn, awer fir e puer Echantillon déi ganz polar oder héich hydrophil ass, kënne regelméisseg C18 Kolonnen Probleemer hunn wann se benotzt gi fir sou Proben ze purifizéieren.Am RPC kënnen déi allgemeng benotzt Elutiounsléisungsmëttel no hirer Polaritéit bestallt ginn: Waasser < Methanol < Acetonitril < Ethanol < Tetrahydrofuran < Isopropanol.Fir eng gutt Retentioun op der Kolonn fir dës Echantillon (staark polar oder héich hydrophil) ze garantéieren, ass en héijen Undeel vum Waassersystem noutwendeg fir als mobil Phase benotzt ze ginn.Wéi och ëmmer, wann Dir e pure Waassersystem (inklusiv reng Waasser oder reng Salzléisung) als mobil Phas benotzt, tendéiert déi laang Kuelestoffkette op der stationärer Phase vun der C18 Kolonn d'Waasser ze vermeiden a mateneen ze vermëschen, wat zu enger direkter Ofsenkung vun der Retentiounskapazitéit vun der Kolonn oder souguer keng Retentioun.Dëst Phänomen gëtt "hydrophobesch Phase Zesummebroch" genannt (wéi am lénksen Deel vun der Figur 1 gewisen).Och wann dës Situatioun reversibel ass wann d'Kolonn mat organesche Léisungsmëttel wéi Methanol oder Acetonitril gewäsch gëtt, kann et ëmmer nach Schued un der Kolonn verursaachen.Dofir ass et néideg fir dës Situatioun ze vermeiden.
Figur 1. De schemateschen Diagramm vun de gebonnen Phasen op der Uewerfläch vum Silikagel an der regulärer C18 Kolonn (lénks) an C18AQ Kolonn (riets).
Fir déi uewe genannte Probleemer unzegoen, hunn d'chromatografesch Verpackungsmaterial Hiersteller technesch Verbesserunge gemaach.Eng vun dëse Verbesserunge mécht e puer Ännerungen op der Uewerfläch vun der Silica Matrix, sou wéi d'Aféierung vun hydrophile Cyanogruppen (wéi am richtegen Deel vun der Figur 1 gewisen), fir d'Uewerfläch vum Silikagel méi hydrophil ze maachen.Sou konnten d'C18 Ketten op der Silica Uewerfläch ënner héich wässerleche Bedéngungen voll verlängert ginn an den hydrophobesche Phasekollaps konnt vermeit ginn.Dës modifizéiert C18 Sailen ginn wässerlech C18 Sailen genannt, nämlech C18AQ Saile, déi fir héich wässerlech Eluéierungsbedéngungen entworf sinn a 100% Waassersystem toleréiere kënnen.C18AQ Säulen goufen wäit an der Trennung an der Reinigung vu staarke polare Verbindungen applizéiert, dorënner organesch Säuren, Peptiden, Nukleosiden a Waasserlöslech Vitamine.
Desalting ass eng vun den typesche Uwendunge vu C18AQ Sailen an der Flashreinigung fir Proben, déi d'Salz oder Pufferkomponenten am Probe-Léisungsmëttel läscht fir d'Applikatioun vun der Probe a spéider Studien ze erliichteren.An dësem Post gouf de Brilliant Blue FCF mat staarker Polaritéit als Probe benotzt an op der C18AQ Kolonn gereinegt.De Probe-Léisungsmëttel gouf duerch organesch Léisungsmëttel aus Pufferléisung ersat, sou datt déi folgend Rotatiounsverdampfung erliichtert wéi och Léisungsmëttel an Operatiounszäit spueren.Ausserdeem gouf d'Rengheet vun der Probe verbessert andeems e puer Gëftstoffer an der Probe ewechgeholl goufen.
Experimentell Sektioun
Figur 2. Déi chemesch Struktur vun der Prouf.
De Brilliant Blue FCF gouf als Probe an dësem Post benotzt.D'Rengheet vun der Matière Probe war 86% an d'chemesch Struktur vun der Probe gouf an der Figur 2 gewisen. Fir d'Proufléisung ze preparéieren, 300 mg puderesch rau Feststoff vu Brilliant Blue FCF gouf an 1 M NaH2PO4 Pufferléisung opgeléist a gutt gerëselt fir ze ginn eng komplett kloer Léisung.D'Probe-Léisung gouf dann an d'Flash-Kolonn vun engem Injektor injizéiert.Den experimentellen Opbau vun der Blitzreinigung ass an der Tabell 1 opgelëscht.
| Instrument | SepaBean™ Maschinn2 | |||
| Patrounen | 12 g SepaFlash C18 RP Flash Cartouche (kugelgestalt Silica, 20 - 45 μm, 100 Å, Bestellnummer: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP Flash Cartouche (kugelgestalt Silica, 20 - 45 μm, 100 Å, Bestellnummer: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Wellelängt | 254 nm | |||
| Mobile Phase | Léisungsmëttel A: Waasser Léisungsmëttel B: Methanol | |||
| Duerchflossrate | 30 ml/min | |||
| Prouf Luede | 300 mg (Brilliant Blue FCF mat der Rengheet vun 86%) | |||
| Gradient | Zeit (CV) | Léisungsmëttel B (%) | Zeit (CV) | Léisungsmëttel B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Resultater an Diskussioun
Eng SepaFlash C18AQ RP Flash Cartouche gouf fir Probe Entsalting a Reinigung benotzt.Schrëttgradient gouf benotzt an deem pure Waasser als mobil Phase am Ufank vun der Elutioun benotzt gouf a fir 10 Kolonnvolumen (CV) lafen.Wéi an der Figur 3 gewisen, wann Dir reng Waasser als mobil Phase benotzt, gouf d'Probe komplett op der Flashpatroun behalen.Als nächst gouf de Methanol an der mobiler Phase direkt op 100% erhéicht an de Gradient gouf fir 7,5 CV behalen.D'Probe gouf vun 11,5 op 13,5 CV eluéiert.An de gesammelten Fraktiounen gouf d'Proufléisung vun der NaH2PO4-Pufferléisung op Methanol ersat.Am Verglach mat héich wässerlecher Léisung war Methanol vill méi einfach duerch Rotatiounsverdampfung an der nächster Schrëtt ze entfernen, wat déi folgend Fuerschung erliichtert.
Figur 3. D'Flash chromatogram vun der Prouf op engem C18AQ Cartouche.
Fir d'Retentiounsverhalen vun der C18AQ Cartouche a regelméisseg C18 Cartouche fir Proben vu staarker Polaritéit ze vergläichen, gouf parallele Vergläichstest gemaach.A SepaFlash C18 RP Flash Cartouche gouf benotzt an de Flash chromatogram fir d'Probe war an der Figur gewisen 4. Fir regelméisseg C18 Patrounen ass den héchste toleréiert Waasser Phase Verhältnis ongeféier 90%.Dofir gouf de Startgradient op 10% Methanol an 90% Waasser gesat.Wéi an der Figur 4 gewisen, wéinst dem hydrophobesche Phase Zesummebroch vun den C18 Ketten verursaacht duerch héije Waasserverhältnis, gouf d'Probe kaum op der regulärer C18 Cartouche behalen a gouf direkt vun der mobiler Phase eluéiert.Als Resultat kann d'Operatioun vun der Probe Desalting oder Puréierung net ofgeschloss ginn.
Figur 4. D'Flash chromatogram vun der Prouf op enger regulärer C18 Cartouche.
Am Verglach mam lineare Gradient huet d'Benotzung vum Schrëttgradient déi folgend Virdeeler:
1. Léisungsmëttelverbrauch a Lafzäit fir Proufreinigung gëtt reduzéiert.
2. D'Zielprodukt eluéiert an engem scharfen Peak, wat de Volume vu gesammelt Fraktiounen reduzéiert an doduerch déi folgend Rotatiounsverdampfung erliichtert an och Zäit spuert.
3. De gesammelt Produkt ass am Methanol deen einfach ze verdampen ass, sou datt d'Trocknungszäit reduzéiert gëtt.
Als Conclusioun, fir d'Reinigung vun der Probe déi staark polar oder héich hydrophil ass, SepaFlash C18AQ RP Flash Patrounen kombinéiert mat dem präparative Flash Chromatographie System SepaBean ™ Machine kéinten eng séier an effizient Léisung ubidden.
Iwwer d'SepaFlash Bonded Serie C18 RP Flash Patrounen
Et ginn eng Serie vun de SepaFlash C18AQ RP Flash Patrounen mat verschiddene Spezifikatioune vun Santai Technology (wéi an Table 2 gewisen).
| Artikelnummer | Kolonn Gréisst | Duerchflossrate (ml/min) | Max.Drock (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5 ,4g | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) Präis | 33g vun | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) Präis | 48g vun | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) Präis | 105 g | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420g vun | 40-80 | 250/17.2 |
Dësch 2. SepaFlash C18AQ RP Flash Patrounen.
Verpackungsmaterial: Héicheffizient kugelfërmeg C18(AQ) gebonnen Silika, 20 - 45 μm, 100 Å.
logy (wéi an Table 2 gewisen).
Post Zäit: Aug-27-2018