Хунчэн Ван, Бо Сю
Колдонмо R&D борбору
Introduction
Стационардык фаза менен кыймылдуу фазанын салыштырмалуу уюлдуктары боюнча суюк хроматографияны нормалдуу фазалык хроматография (NPC) жана тескери фазалык хроматография (RPC) деп бөлүүгө болот.RPC үчүн кыймылдуу фазанын полярдуулугу стационардык фазага караганда күчтүүрөөк.RPC суюк хроматографияны бөлүү режимдеринде анын жогорку эффективдүүлүгү, жакшы чечүүчүлүгү жана так кармап туруу механизми менен эң кеңири колдонулган бири болуп калды.Ошондуктан RPC ар кандай полярдуу же полярдуу эмес кошулмаларды, анын ичинде алкалоиддерди, углеводдорду, май кислоталарын, стероиддерди, нуклеиндик кислоталарды, аминокислоталарды, пептиддерди, белокторду ж.б. бөлүү жана тазалоо үчүн ылайыктуу. RPCде эң көп колдонулган стационардык фаза ар кандай функционалдык топтор менен, анын ичинде C18, C8, C4, фенил, циано, амино, ж.Бул RPC 80% дан ашыгы азыр C18 байланыш фазасын колдонуп жатат деп болжолдонууда.Ошондуктан, C18 хроматография колонкасы ар бир лаборатория үчүн зарыл болгон универсалдуу колонна болуп калды.
C18 тилкеси өтө кеңири чөйрөдө колдонулушу мүмкүн болсо да, өтө полярдуу же өтө гидрофиликтүү кээ бир үлгүлөр үчүн, кадимки C18 мамычалары мындай үлгүлөрдү тазалоо үчүн колдонулганда көйгөйлөр болушу мүмкүн.РПКда кеңири колдонулган элюциялык эриткичтер алардын полярдуулугуна жараша иреттелиши мүмкүн: суу < метанол < ацетонитрил < этанол < тетрагидрофуран < изопропанол.Бул үлгүлөр үчүн (күчтүү полярдуу же өтө гидрофилдик) колонкада жакшы кармалышын камсыз кылуу үчүн суу тутумунун жогорку үлүшүн мобилдик фаза катары колдонуу зарыл.Бирок, кыймылдуу фаза катары таза суу тутумун (анын ичинде таза суу же таза туз эритмеси) колдонгондо, C18 колоннасынын стационардык фазасындагы узун көмүртек чынжырчасы суудан качууга жана бири-бири менен аралашууга умтулат, натыйжада суунун көлөмү бир заматта төмөндөйт. мамычанын кармап туруу жөндөмдүүлүгү же эч кандай кармап калуу.Бул кубулуш "гидрофобдук фазалык коллапс" деп аталат (1-сүрөттүн сол бөлүгүндө көрсөтүлгөндөй).Колонканы метанол же ацетонитрил сыяктуу органикалык эриткичтер менен жууганда бул жагдай кайра кайтарылса да, колонкага зыян келтириши мүмкүн.Ошондуктан мындай абалга жол бербөө зарыл.
Сүрөт 1. Кадимки C18 тилкесинде (солдо) жана C18AQ тилкесинде (оңдо) силикагелдин бетиндеги байланышкан фазалардын схемалык диаграммасы.
Жогоруда айтылган көйгөйлөрдү чечүү үчүн хроматографиялык таңгактоочу материалдарды өндүрүүчүлөр техникалык өркүндөтүштү.Бул жакшыртуулардын бири кремний диоксиди матрицанын бетине кээ бир өзгөртүүлөрдү киргизүү, мисалы, гидрофильдүү циано топторун киргизүү (1-сүрөттүн оң жагында көрсөтүлгөндөй), силикагелдин бетин гидрофиликтүү кылуу.Ошентип, кремнеземдин бетиндеги C18 чынжырлары жогорку суулуу шарттарда толугу менен узартылышы мүмкүн жана гидрофобдук фазанын кыйрашынан сактанууга болот.Бул өзгөртүлгөн C18 мамычалары суулуу C18 мамычалары деп аталат, тактап айтканда C18AQ мамычалары, алар жогорку суулуу эрюу шарттарына ылайыкталган жана 100% суу тутумуна чыдай алат.C18AQ мамычалары күчтүү полярдык кошулмаларды, анын ичинде органикалык кислоталарды, пептиддерди, нуклеозиддерди жана сууда эрүүчү витаминдерди бөлүүдө жана тазалоодо кеңири колдонулат.
Тузсуздандыруу - бул үлгүлөр үчүн флеш тазалоодо C18AQ мамычаларынын типтүү колдонмолорунун бири, ал кийинки изилдөөлөрдө үлгүнү колдонууну жеңилдетүү үчүн үлгү эриткичтеги тузду же буфердик компоненттерди жок кылат.Бул постто, күчтүү полярдуулугу бар Brilliant Blue FCF үлгү катары колдонулган жана C18AQ тилкесинде тазаланган.Үлгү эриткич буфердик эритмеден алынган органикалык эриткич менен алмаштырылды, ошентип кийинки айлануучу бууланууну жеңилдетүү, ошондой эле эриткичтерди жана иштөө убактысын үнөмдөө.Мындан тышкары, үлгүнүн тазалыгы үлгүдөгү кээ бир аралашмаларды алып салуу менен жакшыртылды.
Эксперименталдык бөлүм
Сүрөт 2. Үлгүнүн химиялык түзүлүшү.
Brilliant Blue FCF бул билдирүүдө үлгү катары колдонулган.Чийки үлгүнүн тазалыгы 86%ды түздү жана үлгүнүн химиялык түзүлүшү 2-сүрөттө көрсөтүлгөн. Үлгү эритменин даярдоо үчүн Brilliant Blue FCFдин 300 мг порошок чийки катуу катуу заты 1 M NaH2PO4 буфердик эритмесинде эритип, жакшы чайкалып, 1 М NaH2PO4 эритмесинде эритилди. толугу менен ачык-айкын чечим.Андан кийин үлгү эритмеси инжектор аркылуу флеш колонкага куюлган.Флеш тазалоонун эксперименталдык орнотуулары 1-таблицада келтирилген.
| Инструмент | SepaBean™ машинасы2 | |||
| Картридждер | 12 г SepaFlash C18 RP флеш-картридж (сфералык кремний диоксиди, 20 - 45 мкм, 100 Å, Заказ номери: SW-5222-012-SP) | 12 г SepaFlash C18AQ RP флеш-картридж (сферикалык кремний диоксиди, 20 - 45 мкм, 100 Å, Заказ номери: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Толкун узундугу | 254 нм | |||
| Мобилдик фаза | Эритүүчү А: Суу Эритүүчү В: Метанол | |||
| Агым ылдамдыгы | 30 мл/мин | |||
| Үлгү жүктөө | 300 мг (86% тазалыгы менен Brilliant Blue FCF) | |||
| Градиент | Убакыт (CV) | Эриткич B (%) | Убакыт (CV) | Эриткич B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Жыйынтыктары жана талкуулоо
Үлгү тузсуздандыруу жана тазалоо үчүн SepaFlash C18AQ RP флеш-картриджи колдонулган.Кадам градиенти пайдаланылды, мында таза суу элюциянын башталышында мобилдик фаза катары колдонулган жана 10 колонна көлөмү (CV) үчүн иштетилген.3-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, таза сууну мобилдик фаза катары колдонууда үлгү толугу менен флеш-картриджде сакталып калган.Андан кийин, мобилдик фазадагы метанол түздөн-түз 100% га чейин жогорулаган жана градиент 7,5 CV үчүн сакталган.Үлгү 11,5тен 13,5 CVге чейин элюцияланган.Чогулган фракцияларда үлгү эритмеси NaH2PO4 буфердик эритмесинен метанолго алмаштырылды.Жогорку суулуу эритме менен салыштырганда, метанолду кийинки этапта айлануучу буулантуу жолу менен алып салуу бир топ жеңил болгон, бул кийинки изилдөөлөрдү жеңилдетет.
Сүрөт 3. C18AQ картриджиндеги үлгүнүн флеш хроматограммасы.
Күчтүү полярдуулуктун үлгүлөрү үчүн C18AQ картриджинин жана кадимки C18 картриджинин кармоо жүрүм-турумун салыштыруу үчүн параллелдүү салыштыруу тести аткарылды.SepaFlash C18 RP флеш-картриджи колдонулган жана үлгү үчүн флеш хроматограммасы 4-сүрөттө көрсөтүлгөн. Кадимки C18 картридждер үчүн эң жогорку жол берилген суу фазасынын катышы болжол менен 90% түзөт.Ошентип, баштапкы градиент 90% суудагы 10% метанолго коюлду.4-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, C18 чынжырларынын гидрофобдук фазасынын кыйрашынан улам, жогорку суу катышы шартталган, үлгү кадимки C18 картриджинде дээрлик сакталып калган жана мобилдик фаза менен түздөн-түз элюталанган.Натыйжада, үлгүлөрдү тузсуздандыруу же тазалоо операциясы аягына чыга албайт.
Сүрөт 4. Кадимки C18 картриджиндеги үлгүнүн флеш хроматограммасы.
Сызыктуу градиент менен салыштырганда, кадам градиентти колдонуу төмөнкүдөй артыкчылыктарга ээ:
1. Эриткичти колдонуу жана үлгүнү тазалоо үчүн иштөө убактысы кыскарат.
2. Максаттуу продукт кескин чокусунда элюталанат, бул чогултулган фракциялардын көлөмүн азайтат жана ошону менен кийинки айлануучу бууланууну жеңилдетет, ошондой эле убакытты үнөмдөйт.
3. Чогулган продукт метанолдо болот, аны бууланууга оңой, кургатуу убактысы кыскарат.
Жыйынтыктап айтканда, күчтүү полярдуу же өтө гидрофиликтүү үлгүнү тазалоо үчүн SepaFlash C18AQ RP флеш-картридждери SepaBean™ Machine даярдоочу флеш хроматография системасы менен айкалышып, тез жана натыйжалуу чечимди сунуштай алат.
SepaFlash Bonded Series C18 RP флеш-картридждери жөнүндө
SepaFlash C18AQ RP флэш-картридждеринин сериясы бар, алар Сантай Технологиясынан ар кандай мүнөздөмөлөргө ээ (2-таблицада көрсөтүлгөндөй).
| Элемент номери | Колонна өлчөмү | Flow Rate (мл/мүнөт) | Max.Pressure (psi/бар) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 г | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 г | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 г | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 г | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 г | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 г | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 г | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 г | 40-80 | 250/17.2 |
Таблица 2. SepaFlash C18AQ RP флеш-картридждери.
Таңгактоочу материалдар: Жогорку эффективдүү сфералык C18(AQ) менен байланышкан кремний диоксиди, 20 - 45 мкм, 100 Å.
логия (2-таблицада көрсөтүлгөндөй).
Посттун убактысы: 27-август-2018