Hongcheng Wang, Bo Xu
응용 프로그램 R & D 센터
소개
고정 상 및 이동상의 상대성 극성에 따르면, 액체 크로마토 그래피는 정상 상 크로마토 그래피 (NPC) 및 역상 크로마토 그래피 (RPC)로 나눌 수있다. RPC의 경우, 이동상의 극성은 정지상의 극성보다 강하다. RPC는 고효율, 우수한 해상도 및 명확한 보유 메커니즘으로 인해 액체 크로마토 그래피 분리 모드에서 가장 널리 사용되었습니다. 따라서 RPC는 알칼로이드, 탄수화물, 지방산, 스테로이드, 핵산, 아미노산, 펩타이드, 단백질 등을 포함한 다양한 극성 또는 비극성 화합물의 분리 및 정제에 적합합니다. RPC에서 가장 일반적으로 사용되는 고정 단계는 C18, C4, C4, C4, Peryn을 포함하여 다양한 기능 그룹과 결합되는 실리카 겔 매트릭스입니다. 아미노 등.이 결합 기능 그룹 중에서 가장 널리 사용되는 그룹은 C18입니다. RPC의 80% 이상이 현재 C18 결합 단계를 사용하고있는 것으로 추정됩니다. 따라서 C18 크로마토 그래피 컬럼은 모든 실험실에서 필수 범용 기둥이되었습니다.
그러나 C18 컬럼은 매우 광범위한 응용 분야에서 사용될 수 있지만, 매우 극성 또는 매우 친수성 인 일부 샘플의 경우, 일반 C18 컬럼은 이러한 샘플을 정화하는 데 사용될 때 문제가있을 수 있습니다. RPC에서, 일반적으로 사용되는 용리 용매는 그들의 극성에 따라 주문할 수있다 : 물 <메탄올 <아세토 니트릴 <에탄올 <테트라 하이드로 푸란 <이소프로판올. 이들 샘플 (강한 극성 또는 친수성)에 대한 컬럼에 우수한 보유를 보장하기 위해서는 이동상으로 사용 되려면 높은 비율의 수성 시스템이 필요하다. 그러나, 순수한 물 시스템 (순수한 물 또는 순수한 소금 용액 포함)을 이동상으로 사용할 때, C18 컬럼의 고정상의 긴 탄소 사슬은 물을 피하고 서로 혼합하여 컬럼의 보유 용량이 즉각적으로 감소하거나 유지되지 않는 경향이 있습니다. 이 현상을 "소수성 위상 붕괴"라고합니다 (그림 1의 왼쪽 부분에서 볼 수 있듯이). 이 상황은 컬럼이 메탄올 또는 아세토 니트릴과 같은 유기 용매로 세척 할 때 가역적이지만 여전히 컬럼에 손상을 줄 수 있습니다. 따라서이 상황이 발생하지 않도록해야합니다.
그림 1. 일반 C18 컬럼 (왼쪽) 및 C18AQ 컬럼 (오른쪽)에서 실리카 겔 표면의 결합 상의 개략도.
위에서 언급 한 문제를 해결하기 위해 크로마토 그래피 패킹 재료 제조업체는 기술적으로 개선되었습니다. 이러한 개선 중 하나는 실리카 겔의 표면을보다 친수성으로 만드는 친수성 시아 노 그룹의 도입 (도 1의 오른쪽 부분에 도시 된 바와 같이)과 같은 실리카 매트릭스의 표면에 약간의 변형이있다. 따라서, 실리카 표면의 C18 사슬은 고도로 수성 조건 하에서 완전히 확장 될 수 있으며 소수성 상 붕괴는 피할 수있다. 이 변형 된 C18 컬럼은 수성 C18 컬럼, 즉 C18AQ 컬럼이라고하며, 이는 고도로 수성 용리 조건을 위해 설계되었으며 100% 수성 시스템을 견딜 수 있습니다. C18AQ 컬럼은 유기산, 펩티드, 뉴 클레오 시드 및 수용성 비타민을 포함한 강한 극성 화합물의 분리 및 정제에 널리 적용되어왔다.
탈염은 샘플에 대한 플래시 정제에서 C18AQ 컬럼의 전형적인 응용 중 하나이며, 이는 샘플 용매의 염 또는 완충 성분을 제거하여 후속 연구에서 샘플의 적용을 용이하게한다. 이 게시물에서, 강한 극성을 갖는 화려한 파란색 FCF를 샘플로 사용하고 C18AQ 컬럼에서 정제 하였다. 샘플 용매를 완충 용액으로부터 유기 용매로 대체하여 다음 회전 증발 및 용매 및 작동 시간을 절약 하였다. 또한, 샘플에서 일부 불순물을 제거함으로써 샘플의 순도가 개선되었다.
실험 섹션
그림 2. 샘플의 화학 구조.
화려한 파란색 FCF는이 게시물의 샘플로 사용되었습니다. 원시 샘플의 순도는 86% 였고 샘플의 화학적 구조는도 2에 도시되었다. 샘플 용액을 제조하기 위해, 화려한 파란색 FCF의 300 mg 분말 원유 고체를 1 M NAH2PO4 완충액에 용해시키고 완전히 명확한 용액이되기 위해 잘 흔들었다. 이어서, 샘플 용액을 인젝터에 의해 플래시 컬럼에 주입 하였다. 플래시 정제의 실험 설정은 표 1에 나열되어 있습니다.
| 기구 | Sepabean ™ 기계2 | |||
| 카트리지 | 12 g Sepaflash C18 RP 플래시 카트리지 (구형 실리카, 20-45 μm, 100Å, 주문 번호 : SW-5222-012-SP) | 12 g Sepaflash C18AQ RP 플래시 카트리지 (구형 실리카, 20-45 μm, 100Å, 주문 번호 ： SW-5222-012-SP (AQ)둔다 | ||
| 파장 | 254 nm | |||
| 이동 단계 | 용매 A ： 물 용매 B ： 메탄올 | |||
| 유량 | 30 ml/분 | |||
| 샘플 로딩 | 300 mg (순도는 86%인 화려한 파란색 FCF) | |||
| 구배 | 시간 (CV) | 용매 B (%) | 시간 (CV) | 용매 B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
결과와 토론
SEPAFLASH C18AQ RP 플래시 카트리지를 샘플 탈염 및 정제에 사용 하였다. 용리를 시작할 때 순수한 물이 이동상으로 사용되었고 10 열 볼륨 (CV) 동안 실행되는 계단 구배가 이용되었다. 도 3에 도시 된 바와 같이, 순수한 물을 이동상으로 사용할 때, 샘플은 플래시 카트리지에 완전히 유지되었다. 다음으로, 이동상의 메탄올은 직접 100%로 증가하고 구배는 7.5 cv 동안 유지되었다. 샘플은 11.5에서 13.5 cv로 용리시켰다. 수집 된 분획에서, 샘플 용액을 NAH2PO4 완충액으로부터 메탄올로 대체 하였다. 높은 수성 용액과 비교하여, 메탄올은 후속 단계에서 로터리 증발에 의해 훨씬 쉬워졌으며, 이는 다음 연구를 용이하게한다.
그림 3. C18AQ 카트리지에서 샘플의 플래시 크로마토 그램.
강한 극성 샘플에 대한 C18AQ 카트리지 및 일반 C18 카트리지의 보유 거동을 비교하기 위해 병렬 비교 테스트를 수행 하였다. Sepaflash C18 RP 플래시 카트리지가 사용되었고 샘플의 플래시 크로마토 그램이도 4에 도시되어있다. 일반 C18 카트리지의 경우, 가장 높은 허용 된 수성 상 비율은 약 90%이다. 따라서, 시동 구배는 90% 물에서 10% 메탄올로 설정되었다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 높은 수성 비율로 인한 C18 사슬의 소수성 위상 붕괴로 인해, 샘플은 일반 C18 카트리지에서 거의 보관되지 않았으며 이동 단계에 의해 직접 용출되었다. 결과적으로, 샘플 탈염 또는 정제의 작동은 완료 될 수 없다.
그림 4. 일반 C18 카트리지에서 샘플의 플래시 크로마토 그램.
선형 그라디언트와 비교하여 단계 구배를 사용하면 다음과 같은 장점이 있습니다.
1. 샘플 정제를위한 용매 사용 및 실행 시간이 줄어 듭니다.
2. 대상 제품은 날카로운 피크에서 용화하여 수집 된 분획의 부피를 감소시켜 다음의 회전 증발과 시간 절약을 용이하게한다.
3. 수집 된 생성물은 메탄올로 이루어져 증발하기 쉬우므로 건조 시간이 줄어 듭니다.
결론적으로, 강하게 극성 또는 고도로 친수성 인 샘플의 정제를 위해, Sepaflash C18AQ RP 플래시 카트리지는 분제 플래시 크로마토 그래피 시스템 Sepabean ™ 기계와 결합하여 빠르고 효율적인 솔루션을 제공 할 수있다.
Sepaflash Bonded Series C18 RP 플래시 카트리지 정보
Santai 기술과는 다른 사양을 가진 Sepaflash C18AQ RP 플래시 카트리지가 일련의 일련의 표 2에 표시되어 있습니다.
| 항목 번호 | 열 크기 | 유량 (ml/min) | 최대 압력 (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
표 2. Sepaflash C18AQ RP 플래시 카트리지.
포장 재료 : 고효율 구형 C18 (AQ)-본드 실리카, 20-45 μm, 100Å.
로지 (표 2에 표시된 바와 같이).
후 시간 : 2018 년 8 월 27 일