Hongcheng Wang, Bo Xu
응용 R&D 센터
소개
고정상과 이동상의 상대적 극성에 따라 액체 크로마토그래피는 순상 크로마토그래피(NPC)와 역상 크로마토그래피(RPC)로 나눌 수 있습니다.RPC의 경우 이동상의 극성이 고정상의 극성보다 강합니다.RPC는 고효율, 우수한 분해능 및 명확한 보유 메커니즘으로 인해 액체 크로마토그래피 분리 모드에서 가장 널리 사용되는 것이 되었습니다.따라서 RPC는 알칼로이드, 탄수화물, 지방산, 스테로이드, 핵산, 아미노산, 펩타이드, 단백질 등을 포함한 다양한 극성 또는 비극성 화합물의 분리 및 정제에 적합합니다. RPC에서 가장 일반적으로 사용되는 고정상은 C18, C8, C4, 페닐, 시아노, 아미노 등의 다양한 관능기가 결합된 실리카 겔 매트릭스. 이들 결합된 관능기 중 가장 널리 사용되는 것은 C18이다.현재 RPC의 80% 이상이 C18 결합상을 사용하고 있는 것으로 추정됩니다.따라서 C18 크로마토그래피 컬럼은 모든 실험실의 필수 범용 컬럼이 되었습니다.
C18 컬럼은 매우 광범위한 응용 분야에서 사용할 수 있지만 극성이 매우 높거나 친수성이 높은 일부 샘플의 경우 일반 C18 컬럼을 이러한 샘플을 정제하는 데 사용할 때 문제가 발생할 수 있습니다.RPC에서 일반적으로 사용되는 용리 용매는 극성에 따라 물 < 메탄올 < 아세토니트릴 < 에탄올 < 테트라히드로푸란 < 이소프로판올 순서로 정렬할 수 있습니다.이러한 샘플(강한 극성 또는 높은 친수성)에 대해 컬럼에서 우수한 머무름을 보장하려면 높은 비율의 수성 시스템을 이동상으로 사용해야 합니다.그러나 순수한 물 시스템(순수 또는 순수한 염 용액 포함)을 이동상으로 사용하는 경우 C18 컬럼의 고정상에 있는 긴 탄소 사슬은 물을 기피하고 서로 혼합되는 경향이 있어 컬럼의 보유 용량 또는 보유 없음.이 현상을 "소수성 상 붕괴"라고 합니다(그림 1의 왼쪽 부분 참조).이 상황은 메탄올이나 아세토니트릴과 같은 유기 용매로 컬럼을 세척하면 되돌릴 수 있지만 여전히 컬럼에 손상을 줄 수 있습니다.따라서 이러한 상황이 발생하지 않도록 방지하는 것이 필요합니다.
그림 1. 일반 C18 컬럼(왼쪽)과 C18AQ 컬럼(오른쪽)에서 실리카겔 표면의 결합상의 개략도.
위에서 언급한 문제를 해결하기 위해 크로마토그래피 포장재 제조업체는 기술적인 개선을 이루었습니다.이러한 개선 사항 중 하나는 실리카 겔 표면을 보다 친수성으로 만들기 위해 친수성 시아노 그룹(그림 1의 오른쪽 부분에 표시됨)을 도입하는 것과 같이 실리카 매트릭스 표면에 약간의 변형을 가하는 것입니다.따라서 실리카 표면의 C18 사슬은 높은 수성 조건에서 완전히 확장될 수 있으며 소수성 상 붕괴를 피할 수 있습니다.이러한 수정된 C18 컬럼은 수성 C18 컬럼, 즉 C18AQ 컬럼이라고 하며 높은 수성 용리 조건을 위해 설계되었으며 100% 수성 시스템을 견딜 수 있습니다.C18AQ 컬럼은 유기산, 펩타이드, 뉴클레오시드 및 수용성 비타민을 포함한 강한 극성 화합물의 분리 및 정제에 널리 적용되었습니다.
탈염은 샘플의 순간 정제에서 C18AQ 컬럼의 일반적인 응용 분야 중 하나로, 샘플 용매에서 염 또는 완충 성분을 제거하여 후속 연구에서 샘플 적용을 용이하게 합니다.이번 포스트에서는 극성이 강한 Brilliant Blue FCF를 샘플로 사용하여 C18AQ 컬럼에서 정제했습니다.샘플 용매는 완충 용액의 유기 용매로 대체되어 다음 회전 증발을 용이하게 하고 용매 및 작동 시간을 절약합니다.또한 시료의 일부 불순물을 제거하여 시료의 순도를 향상시켰다.
실험 섹션
그림 2. 샘플의 화학 구조.
이 게시물에서는 Brilliant Blue FCF를 샘플로 사용했습니다.원시 샘플의 순도는 86%였으며 샘플의 화학 구조는 그림 2에 나와 있습니다. 샘플 용액을 준비하기 위해 Brilliant Blue FCF의 분말 조 고체 300mg을 1M NaH2PO4 완충 용액에 용해하고 잘 흔들어서 완전히 명확한 해결책.그런 다음 샘플 용액을 주입기에 의해 플래시 컬럼에 주입했습니다.플래시 정화의 실험 설정은 표 1에 나열되어 있습니다.
| 기구 | SepaBean™ 기계2 | |||
| 카트리지 | 12g SepaFlash C18 RP 플래시 카트리지(구형 실리카, 20 - 45μm, 100Å, 주문 번호: SW-5222-012-SP) | 12g SepaFlash C18AQ RP 플래시 카트리지(구형 실리카, 20 - 45μm, 100Å, 주문 번호: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| 파장 | 254nm | |||
| 이동상 | 용매 A: 물 용매 B: 메탄올 | |||
| 유량 | 30mL/분 | |||
| 샘플 로딩 | 300mg (순도 86% 브릴리언트 블루 FCF) | |||
| 구배 | 시간(이력서) | 용매 B(%) | 시간(이력서) | 용매 B(%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
결과 및 논의
샘플 탈염 및 정제에는 SepaFlash C18AQ RP 플래시 카트리지가 사용되었습니다.용리 시작 시 순수한 물을 이동상으로 사용하고 10 컬럼 부피(CV)에 대해 실행하는 단계 구배를 활용했습니다.그림 3에서와 같이 순수를 이동상으로 사용하면 샘플이 플래시 카트리지에 완전히 남습니다.다음으로, 이동상의 메탄올은 100%까지 직접적으로 증가되었고 구배는 7.5 CV 동안 유지되었습니다.샘플은 11.5에서 13.5 CV로 용출되었습니다.수집된 분획에서 샘플 용액을 NaH2PO4 완충액에서 메탄올로 대체하였다.고 수용액과 비교하여 메탄올은 후속 단계에서 회전 증발에 의해 훨씬 쉽게 제거되어 다음 연구를 용이하게 합니다.
그림 3. C18AQ 카트리지에 있는 샘플의 플래시 크로마토그램.
극성이 강한 샘플에 대한 C18AQ 카트리지와 일반 C18 카트리지의 유지 거동을 비교하기 위해 병렬 비교 테스트를 수행했습니다.SepaFlash C18 RP 플래시 카트리지가 사용되었으며 샘플의 플래시 크로마토그램이 그림 4에 나와 있습니다. 일반 C18 카트리지의 경우 허용되는 최고 수성상 비율은 약 90%입니다.따라서 시작 구배는 90% 물 중 10% 메탄올로 설정되었습니다.그림 4에서 볼 수 있듯이 높은 수성 비율로 인한 C18 사슬의 소수성 상 붕괴로 인해 샘플이 일반 C18 카트리지에 거의 남지 않고 이동상에 의해 직접 용출되었습니다.결과적으로 샘플 탈염 또는 정제 작업을 완료할 수 없습니다.
그림 4. 일반 C18 카트리지에 있는 샘플의 플래시 크로마토그램.
선형 그래디언트와 비교하여 단계 그래디언트를 사용하면 다음과 같은 이점이 있습니다.
1. 시료 정제를 위한 용매 사용량 및 실행 시간이 단축됩니다.
2. 대상 생성물이 날카로운 피크로 용출되어 포집된 분획의 부피가 줄어들어 다음 회전 증발이 용이하고 시간이 절약됩니다.
3. 포집된 제품은 증발하기 쉬운 메탄올에 있어 건조시간이 단축된다.
결론적으로, 극성이 강하거나 친수성이 높은 시료의 정제를 위해 SepaFlash C18AQ RP 플래시 카트리지와 분취용 플래시 크로마토그래피 시스템인 SepaBean™ Machine을 결합하면 빠르고 효율적인 솔루션을 제공할 수 있습니다.
SepaFlash Bonded Series C18 RP 플래시 카트리지 정보
Santai Technology와 사양이 다른 일련의 SepaFlash C18AQ RP 플래시 카트리지가 있습니다(표 2 참조).
| 품목 번호 | 열 크기 | 유량 (mL/분) | 최대 압력 (psi/바) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 그램 | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420g | 40-80 | 250/17.2 |
표 2. SepaFlash C18AQ RP 플래시 카트리지.
패킹 재료: 고효율 구형 C18(AQ) 결합 실리카, 20 - 45 μm, 100 Å.
로지(표 2 참조).
게시 시간: 2018년 8월 27일