Хунчэн Ван, Бо Сю
Қолданбалы ҒЗТКЖ орталығы
Кіріспе
Қозғалмайтын фазаның және жылжымалы фазаның салыстырмалы полярлығы бойынша сұйық хроматографияны қалыпты фазалық хроматография (НФК) және кері фазалық хроматография (RPC) деп бөлуге болады.RPC үшін жылжымалы фазаның полярлығы стационарлық фазаға қарағанда күштірек.RPC жоғары тиімділікке, жақсы ажыратымдылыққа және анық ұстау механизміне байланысты сұйық хроматографияны бөлу режимдерінде ең кең қолданылатынына айналды.Сондықтан RPC әртүрлі полярлы немесе полярлы емес қосылыстарды, соның ішінде алкалоидтарды, көмірсуларды, май қышқылдарын, стероидтерді, нуклеин қышқылдарын, амин қышқылдарын, пептидтерді, ақуыздарды және т.б. бөлу және тазарту үшін жарамды. RPC-де ең жиі қолданылатын стационарлық фаза болып табылады. әртүрлі функционалды топтармен, соның ішінде C18, C8, C4, фенил, циано, амино және т.б. байланысқан силикагель матрицасы. Осы байланыстырылған функционалды топтардың ішінде ең көп қолданылатыны C18 болып табылады.Қазіргі уақытта RPC-нің 80%-дан астамы C18 байланысқан фазасын пайдаланады деп есептеледі.Сондықтан C18 хроматографиялық колонна әрбір зертхана үшін әмбебап колоннаға айналды.
C18 бағанасын қолданудың өте кең ауқымында қолдануға болатынына қарамастан, өте полярлы немесе жоғары гидрофильді кейбір үлгілер үшін әдеттегі C18 бағандары осындай үлгілерді тазарту үшін пайдаланылған кезде проблемалар болуы мүмкін.RPC-де жиі қолданылатын элюционды еріткіштерді олардың полярлығына қарай ретке келтіруге болады: су < метанол < ацетонитрил < этанол < тетрагидрофуран < изопропанол.Бұл үлгілер үшін (күшті полярлы немесе жоғары гидрофильді) бағанада жақсы ұстауды қамтамасыз ету үшін жылжымалы фаза ретінде сулы жүйенің жоғары үлесін пайдалану қажет.Дегенмен, жылжымалы фаза ретінде таза су жүйесін (таза суды немесе таза тұз ерітіндісін қоса) пайдаланған кезде, C18 бағанының стационарлық фазасындағы ұзын көміртегі тізбегі судан аулақ болуға және бір-бірімен араласуға бейім, нәтижесінде судың лезде төмендеуіне әкеледі. бағанның ұстап тұру қабілеті немесе тіпті ұстамау.Бұл құбылыс «гидрофобты фазаның құлдырауы» деп аталады (1-суреттің сол жағында көрсетілгендей).Бұл жағдай колонканы метанол немесе ацетонитрил сияқты органикалық еріткіштермен жуған кезде қайтымды болса да, ол әлі де колоннаға зақым келтіруі мүмкін.Сондықтан мұндай жағдайдың алдын алу қажет.
Сурет 1. Кәдімгі C18 бағанындағы (сол жақта) және C18AQ бағанындағы (оң жақта) силикагель бетіндегі байланысқан фазалардың схемалық диаграммасы.
Жоғарыда аталған мәселелерді шешу үшін хроматографиялық орама материалдарын өндірушілер техникалық жетілдірулер жасады.Осы жақсартулардың бірі кремний диоксиді матрицасының бетіне кейбір модификацияларды енгізу болып табылады, мысалы, гидрофильді цианотоптарды енгізу (1-суреттің оң жағында көрсетілгендей), кремний гелінің бетін гидрофильді ету.Осылайша, кремний диоксиді бетіндегі C18 тізбектерін жоғары сулы жағдайларда толығымен ұзартуға және гидрофобты фазаның құлауын болдырмауға болады.Бұл өзгертілген C18 бағандары сулы C18 бағандары деп аталады, атап айтқанда C18AQ бағандары, олар жоғары сулы ерітінді жағдайларына арналған және 100% сулы жүйеге шыдай алады.C18AQ бағандары күшті полярлық қосылыстарды, соның ішінде органикалық қышқылдарды, пептидтерді, нуклеозидтерді және суда еритін витаминдерді бөлу және тазалауда кеңінен қолданылды.
Тұзсыздандыру - кейінгі зерттеулерде үлгіні қолдануды жеңілдету үшін үлгі еріткішіндегі тұзды немесе буферлік құрамдастарды кетіретін үлгілерге арналған жарқыл тазалауда C18AQ бағандарының типтік қолданбаларының бірі.Бұл жазбада күшті полярлығы бар Brilliant Blue FCF үлгі ретінде пайдаланылды және C18AQ бағанында тазартылды.Үлгі еріткіш буферлік ерітіндідегі органикалық еріткішпен ауыстырылды, осылайша келесі айналмалы булануды жеңілдету, сондай-ақ еріткіштер мен жұмыс уақытын үнемдеу.Сонымен қатар, үлгідегі кейбір қоспаларды жою арқылы үлгінің тазалығы жақсарды.
Эксперименттік бөлім
Сурет 2. Үлгінің химиялық құрылымы.
Brilliant Blue FCF осы постта үлгі ретінде пайдаланылды.Шикізат үлгісінің тазалығы 86% болды және үлгінің химиялық құрылымы 2-суретте көрсетілген. Үлгі ерітіндісін дайындау үшін 300 мг Brilliant Blue FCF қатты ұнтақ 1 М NaH2PO4 буферлік ерітіндісінде ерітілді және жақсылап шайқады. толық айқын шешім.Содан кейін үлгі ерітіндісі инжектор арқылы жарқыл бағанасына енгізілді.Жарқылмен тазалаудың эксперименттік қондырғысы 1-кестеде келтірілген.
| Құрал | SepaBean™ машинасы2 | |||
| Картридждер | 12 г SepaFlash C18 RP флэш-картриджі (сфералық кремний диоксиді, 20 - 45 мкм, 100 Å, Тапсырыс нөмірі: SW-5222-012-SP) | 12 г SepaFlash C18AQ RP флэш-картриджі (сфералық кремний диоксиді, 20 - 45 мкм, 100 Å, Тапсырыс нөмірі: SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Толқын ұзындығы | 254 нм | |||
| Мобильді кезең | Еріткіш A: Су Еріткіш B: метанол | |||
| Ағын жылдамдығы | 30 мл/мин | |||
| Үлгіні жүктеу | 300 мг (тазалығы 86% Бриллиант көк FCF) | |||
| Градиент | Уақыт (CV) | B еріткіш (%) | Уақыт (CV) | B еріткіш (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Нәтижелер мен пікірталас
Үлгіні тұзсыздандыру және тазарту үшін SepaFlash C18AQ RP флэш-картриджі пайдаланылды.Элюцияның басында жылжымалы фаза ретінде таза су пайдаланылған және 10 баған көлемі (CV) үшін жұмыс істейтін қадамдық градиент пайдаланылды.3-суретте көрсетілгендей, жылжымалы фаза ретінде таза суды пайдаланған кезде үлгі толығымен флэш-картриджде сақталды.Әрі қарай, жылжымалы фазадағы метанол тікелей 100% дейін көтерілді және градиент 7,5 CV үшін сақталды.Үлгі 11,5-тен 13,5 CV-ге дейін элюцияланды.Жиналған фракцияларда үлгі ерітіндісі NaH2PO4 буферлік ерітіндісінен метанолға ауыстырылды.Жоғары сулы ерітіндімен салыстырғанда метанолды келесі қадамда айналмалы булану арқылы алу әлдеқайда оңай болды, бұл келесі зерттеулерді жеңілдетеді.
Сурет 3. C18AQ картриджіндегі үлгінің флэш-хроматограммасы.
Күшті полярлық үлгілер үшін C18AQ картриджі мен кәдімгі C18 картриджінің ұстау әрекетін салыстыру үшін параллель салыстыру сынағы орындалды.SepaFlash C18 RP флэш-картриджі пайдаланылды және үлгіге арналған флэш-хроматограмма 4-суретте көрсетілген. Кәдімгі C18 картридждері үшін ең жоғары рұқсат етілген су фазасының қатынасы шамамен 90% құрайды.Сондықтан бастапқы градиент 90% судағы 10% метанолға орнатылды.4-суретте көрсетілгендей, C18 тізбегінің гидрофобты фазасының ыдырауына байланысты жоғары су қатынасы нәтижесінде үлгі қалыпты C18 картриджінде әрең ұсталды және жылжымалы фаза арқылы тікелей элюцияланды.Нәтижесінде үлгіні тұзсыздандыру немесе тазарту операциясы аяқталмайды.
Сурет 4. Кәдімгі C18 картриджіндегі үлгінің флэш-хроматограммасы.
Сызықтық градиентпен салыстырғанда қадамдық градиентті пайдалану келесі артықшылықтарға ие:
1. Ерітіндіні пайдалану және үлгіні тазалау үшін жұмыс уақыты қысқарады.
2. Мақсатты өнім күрт шыңда элюталанады, бұл жиналған фракциялардың көлемін азайтады және осылайша келесі айналмалы булануды жеңілдетеді, сонымен қатар уақытты үнемдейді.
3. Жиналған өнім булануы оңай метанолда болады, осылайша кептіру уақыты қысқарады.
Қорытындылай келе, қатты полярлы немесе жоғары гидрофильді үлгіні тазарту үшін SepaBean™ Machine препараттық флеш хроматография жүйесімен біріктірілген SepaFlash C18AQ RP флеш картридждері жылдам және тиімді шешім ұсына алады.
SepaFlash Bonded Series C18 RP флэш-картридждері туралы
SepaFlash C18AQ RP флэш-картридждерінің сериясы Santai Technology-тен әртүрлі сипаттамаларға ие (2-кестеде көрсетілгендей).
| Заттың нөмірі | Баған өлшемі | Ағын жылдамдығы (мл/мин) | Максималды қысым (psi/бар) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 г | 5-15 | 400/27,5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 г | 10-25 | 400/27,5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 г | 15-30 | 400/27,5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 г | 25-50 | 350/24,0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 г | 30-60 | 300/20,7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 г | 40-80 | 300/20,7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 г | 40-80 | 250/17.2 |
Кесте 2. SepaFlash C18AQ RP флэш-картридждері.
Орам материалдары: С18(AQ)-байланысқан жоғары тиімді сфералық кремний диоксиді, 20 - 45 мкм, 100 Å.
логика (2-кестеде көрсетілгендей).
Жіберу уақыты: 27 тамыз 2018 ж