ჰონგჩენგ ვანგი, ბო ქსუ
განაცხადის R&D ცენტრი
შესავალი
სტაციონარული ფაზის და მოძრავი ფაზის ფარდობითი პოლარობის მიხედვით, თხევადი ქრომატოგრაფია შეიძლება დაიყოს ნორმალურ ფაზის ქრომატოგრაფიად (NPC) და შებრუნებული ფაზის ქრომატოგრაფიად (RPC).RPC-სთვის, მობილური ფაზის პოლარობა უფრო ძლიერია, ვიდრე სტაციონარული ფაზის.RPC გახდა ყველაზე ფართოდ გამოყენებული თხევადი ქრომატოგრაფიის გამოყოფის რეჟიმებში მისი მაღალი ეფექტურობის, კარგი გარჩევადობის და მკაფიო შეკავების მექანიზმის გამო.ამიტომ RPC შესაფერისია სხვადასხვა პოლარული ან არაპოლარული ნაერთების, მათ შორის ალკალოიდების, ნახშირწყლების, ცხიმოვანი მჟავების, სტეროიდების, ნუკლეინის მჟავების, ამინომჟავების, პეპტიდების, ცილების და ა.შ. გამოყოფისა და გასაწმენდად. RPC-ში ყველაზე ხშირად გამოყენებული სტაციონარული ფაზაა. სილიკა გელის მატრიცა, რომელიც დაკავშირებულია სხვადასხვა ფუნქციურ ჯგუფებთან, მათ შორის C18, C8, C4, ფენილი, ციანო, ამინო და ა.შ. ამ შეკრულ ფუნქციურ ჯგუფებს შორის ყველაზე ფართოდ გამოიყენება C18.სავარაუდოა, რომ RPC-ის 80%-ზე მეტი ახლა იყენებს C18 შეკრულ ფაზას.ამიტომ C18 ქრომატოგრაფიის სვეტი გახდა აუცილებელი უნივერსალური სვეტი ყველა ლაბორატორიისთვის.
მიუხედავად იმისა, რომ C18 სვეტი შეიძლება გამოყენებულ იქნას აპლიკაციების ძალიან ფართო სპექტრში, თუმცა ზოგიერთი ნიმუშისთვის, რომელიც არის ძალიან პოლარული ან ძალიან ჰიდროფილური, ჩვეულებრივ C18 სვეტებს შეიძლება ჰქონდეთ პრობლემები ასეთი ნიმუშების გასაწმენდად გამოყენებისას.RPC-ში საყოველთაოდ გამოყენებული ელუციური გამხსნელები შეიძლება დაიყოს პოლარობის მიხედვით: წყალი < მეთანოლი < აცეტონიტრილი < ეთანოლი < ტეტრაჰიდროფურანი < იზოპროპანოლი.ამ ნიმუშების სვეტზე კარგი შეკავების უზრუნველსაყოფად (ძლიერი პოლარული ან უაღრესად ჰიდროფილური), საჭიროა წყლის სისტემის მაღალი პროპორციის გამოყენება მოძრავ ფაზაში.თუმცა, სუფთა წყლის სისტემის (მათ შორის, სუფთა წყლის ან სუფთა მარილის ხსნარის) მობილურ ფაზად გამოყენებისას, C18 სვეტის სტაციონარულ ფაზაზე გრძელი ნახშირბადის ჯაჭვი მიდრეკილია თავიდან აიცილოს წყალი და შეურიოს ერთმანეთს, რაც იწვევს მყისიერ შემცირებას. სვეტის შეკავების უნარი ან თუნდაც შეკავების გარეშე.ამ ფენომენს ეწოდება "ჰიდროფობიური ფაზის კოლაფსი" (როგორც ნაჩვენებია სურათი 1-ის მარცხენა ნაწილში).თუმცა ეს სიტუაცია შექცევადია, როდესაც სვეტი გარეცხილია ორგანული გამხსნელებით, როგორიცაა მეთანოლი ან აცეტონიტრილი, მან მაინც შეიძლება გამოიწვიოს სვეტის დაზიანება.ამიტომ აუცილებელია ამ სიტუაციის თავიდან აცილება.
სურათი 1. შეკრული ფაზების სქემატური დიაგრამა სილიკა გელის ზედაპირზე ჩვეულებრივ C18 სვეტში (მარცხნივ) და C18AQ სვეტში (მარჯვნივ).
ზემოაღნიშნული პრობლემების გადასაჭრელად, ქრომატოგრაფიული შესაფუთი მასალების მწარმოებლებმა განახორციელეს ტექნიკური გაუმჯობესება.ერთ-ერთი ასეთი გაუმჯობესებაა სილიციუმის მატრიცის ზედაპირზე გარკვეული ცვლილებების შეტანა, როგორიცაა ჰიდროფილური ციანო ჯგუფების შემოღება (როგორც ნაჩვენებია სურათი 1-ის მარჯვენა ნაწილში), რათა სილიკა გელის ზედაპირი უფრო ჰიდროფილური გახდეს.ამრიგად, სილიციუმის დიოქსიდის ზედაპირზე C18 ჯაჭვები შეიძლება მთლიანად გაფართოვდეს მაღალი წყლის პირობებში და ჰიდროფობიური ფაზის კოლაფსი თავიდან იქნას აცილებული.ამ მოდიფიცირებულ C18 სვეტებს უწოდებენ წყლის C18 სვეტებს, კერძოდ, C18AQ სვეტებს, რომლებიც შექმნილია მაღალი წყლის გამორეცხვის პირობებისთვის და შეუძლია მოითმინოს 100% წყლის სისტემა.C18AQ სვეტები ფართოდ გამოიყენება ძლიერი პოლარული ნაერთების, მათ შორის ორგანული მჟავების, პეპტიდების, ნუკლეოზიდების და წყალში ხსნადი ვიტამინების გამოყოფისა და გაწმენდისთვის.
მარილის მოხსნა არის C18AQ სვეტების ერთ-ერთი ტიპიური გამოყენება ნიმუშების ფლეშ გამწმენდში, რომელიც შლის მარილს ან ბუფერულ კომპონენტებს ნიმუშის გამხსნელში, რათა ხელი შეუწყოს ნიმუშის გამოყენებას შემდგომ კვლევებში.ამ პოსტში, Brilliant Blue FCF ძლიერი პოლარობით იქნა გამოყენებული ნიმუშად და გაწმენდილი C18AQ სვეტზე.ნიმუშის გამხსნელი შეიცვალა ორგანული გამხსნელით ბუფერული ხსნარიდან, რითაც ხელი შეუწყო შემდეგ მბრუნავ აორთქლებას, ასევე დაზოგავს გამხსნელებს და მუშაობის დროს.გარდა ამისა, ნიმუშის სისუფთავე გაუმჯობესდა ნიმუშში გარკვეული მინარევების მოცილებით.
ექსპერიმენტული განყოფილება
სურათი 2. ნიმუშის ქიმიური სტრუქტურა.
ამ პოსტში ნიმუშად გამოიყენეს Brilliant Blue FCF.ნედლი ნიმუშის სისუფთავე იყო 86% და ნიმუშის ქიმიური სტრუქტურა ნაჩვენები იყო სურათზე 2. ნიმუშის ხსნარის მოსამზადებლად, 300 მგ ფხვნილი ნედლი მყარი მყარი ბრილიანტი ცისფერი FCF იხსნება 1 M NaH2PO4 ბუფერულ ხსნარში და კარგად შეანჯღრევს. სრულიად გამჭვირვალე ხსნარი.ნიმუშის ხსნარი შემდეგ შეჰყავდათ ფლეშ სვეტში ინჟექტორის საშუალებით.ფლეშის გაწმენდის ექსპერიმენტული დაყენება მოცემულია ცხრილში 1.
| ინსტრუმენტი | SepaBean™ მანქანა2 | |||
| ვაზნები | 12 გ SepaFlash C18 RP ფლეშ ვაზნა (სფერული სილიციუმი, 20 - 45 μm, 100 Å, შეკვეთის ნომერი: SW-5222-012-SP) | 12 გ SepaFlash C18AQ RP ფლეშ ვაზნა (სფერული სილიციუმი, 20 - 45 μm, 100 Å, შეკვეთის ნომერი: SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| ტალღის სიგრძე | 254 ნმ | |||
| მობილური ფაზა | გამხსნელი A: წყალი გამხსნელი B: მეთანოლი | |||
| Დინების სიჩქარე | 30 მლ/წთ | |||
| ნიმუშის ჩატვირთვა | 300 მგ (Brilliant Blue FCF 86%) სისუფთავით | |||
| გრადიენტი | დრო (CV) | გამხსნელი B (%) | დრო (CV) | გამხსნელი B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Შედეგები და დისკუსია
SepaFlash C18AQ RP ფლეშ ვაზნა გამოიყენებოდა ნიმუშების მარილის მოსაშორებლად და გასაწმენდად.გამოყენებული იყო საფეხურის გრადიენტი, რომელშიც სუფთა წყალი გამოიყენებოდა მოძრავ ფაზად გამორეცხვის დასაწყისში და გაშვებული იყო 10 სვეტის მოცულობისთვის (CV).როგორც მე-3 სურათზეა ნაჩვენები, სუფთა წყლის მობილურ ფაზად გამოყენებისას, ნიმუში მთლიანად ინახებოდა ფლეშ კარტრიჯზე.შემდეგ, მობილურ ფაზაში მეთანოლი პირდაპირ გაიზარდა 100%-მდე და გრადიენტი შენარჩუნდა 7.5 CV-ზე.ნიმუში გამოირეცხებოდა 11.5-დან 13.5 CV-მდე.შეგროვებულ ფრაქციებში ნიმუშის ხსნარი შეიცვალა NaH2PO4 ბუფერული ხსნარიდან მეთანოლში.უაღრესად წყალხსნართან შედარებით, მეთანოლის მოცილება ბევრად უფრო ადვილი იყო შემდგომ ეტაპზე მბრუნავი აორთქლების გზით, რაც ხელს უწყობს შემდეგ კვლევას.
სურათი 3. ნიმუშის ფლეშ ქრომატოგრამა C18AQ ვაზნაზე.
ძლიერი პოლარობის ნიმუშებისთვის C18AQ ვაზნის და ჩვეულებრივი C18 ვაზნის შეკავების ქცევის შესადარებლად ჩატარდა პარალელური შედარების ტესტი.გამოყენებული იქნა SepaFlash C18 RP ფლეშ ვაზნა და ნიმუშის ფლეშ ქრომატოგრამა ნაჩვენები იყო სურათზე 4. ჩვეულებრივი C18 ვაზნებისთვის, ყველაზე მაღალი ტოლერანტული წყლის ფაზის თანაფარდობა არის დაახლოებით 90%.ამიტომ საწყისი გრადიენტი დაყენებული იყო 10% მეთანოლზე 90% წყალში.როგორც 4 სურათზეა ნაჩვენები, C18 ჯაჭვების ჰიდროფობიური ფაზის კოლაფსის გამო, რომელიც გამოწვეულია მაღალი წყლიანი თანაფარდობით, ნიმუში ძლივს ინახებოდა ჩვეულებრივ C18 ვაზნაზე და პირდაპირ გამოირეცხებოდა მობილური ფაზაში.შედეგად, ნიმუშის დემარილების ან გაწმენდის ოპერაცია ვერ დასრულდება.
სურათი 4. ნიმუშის ფლეშ ქრომატოგრამა ჩვეულებრივ C18 ვაზნაზე.
ხაზოვან გრადიენტთან შედარებით, საფეხურის გრადიენტის გამოყენებას აქვს შემდეგი უპირატესობები:
1. მცირდება გამხსნელის მოხმარება და ნიმუშის გაწმენდის დრო.
2. სამიზნე პროდუქტი ელუტა მკვეთრ პიკში, რაც ამცირებს შეგროვებული ფრაქციების მოცულობას და ამით ხელს უწყობს შემდეგ მბრუნავ აორთქლებას და ასევე დროის დაზოგვას.
3. შეგროვებული პროდუქტი მეთანოლშია, რომელიც ადვილად აორთქლდება, რითაც მცირდება გაშრობის დრო.
დასასრულს, ძლიერ პოლარული ან ძლიერ ჰიდროფილური ნიმუშის გასაწმენდად, SepaFlash C18AQ RP ფლეშ ვაზნამ, რომელიც აერთიანებს მოსამზადებელ ფლეშ ქრომატოგრაფიულ სისტემას SepaBean™ Machine, შეიძლება შესთავაზოს სწრაფი და ეფექტური გადაწყვეტა.
SepaFlash Bonded Series C18 RP ფლეშ ვაზნების შესახებ
არსებობს SepaFlash C18AQ RP ფლეშ ვაზნების სერია Santai Technology-სგან განსხვავებული სპეციფიკაციებით (როგორც ნაჩვენებია ცხრილში 2).
| პუნქტის ნომერი | სვეტის ზომა | Დინების სიჩქარე (მლ/წთ) | მაქს.წნევა (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 გ | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 გ | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 გ | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 გ | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 გ | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 გ | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 გ | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 გ | 40-80 | 250/17.2 |
ცხრილი 2. SepaFlash C18AQ RP ფლეშ ვაზნები.
შესაფუთი მასალები: მაღალი ეფექტურობის სფერული C18(AQ) შეკრული სილიციუმი, 20 - 45 μm, 100 Å.
ლოგიკა (როგორც ნაჩვენებია ცხრილში 2).
გამოქვეყნების დრო: Aug-27-2018