Hongcheng Wang, Bo Xu
Pusat R&D Aplikasi
Pambuka
Miturut polaritas relatif fase stasioner lan fase gerak, kromatografi cair bisa dipérang dadi kromatografi fase normal (NPC) lan kromatografi fase terbalik (RPC).Kanggo RPC, polaritas fase seluler luwih kuwat tinimbang fase stasioner.RPC wis dadi sing paling akeh digunakake ing mode pamisahan kromatografi cair amarga efisiensi dhuwur, resolusi apik lan mekanisme retensi sing jelas.Mulane RPC cocok kanggo pamisahan lan pemurnian macem-macem senyawa polar utawa non-polar, kalebu alkaloid, karbohidrat, asam lemak, steroid, asam nukleat, asam amino, peptida, protein, lan sapiturute. Ing RPC, fase stasioner sing paling umum digunakake yaiku matriks gel silika sing kaiket karo macem-macem gugus fungsi, kalebu C18, C8, C4, fenil, cyano, amino, lan liya-liyane. Ing antarane gugus fungsi ikatan kasebut, sing paling akeh digunakake yaiku C18.Dikira luwih saka 80% RPC saiki nggunakake fase ikatan C18.Mulane kolom kromatografi C18 wis dadi kolom universal sing kudu diduweni kanggo saben laboratorium.
Senajan kolom C18 bisa digunakake ing sawetara banget saka sudhut aplikasi, Nanging, kanggo sawetara conto kang banget polar utawa Highly hidrofilik, kolom C18 biasa bisa duwe masalah nalika digunakake kanggo ngresiki conto kuwi.Ing RPC, pelarut elusi sing umum digunakake bisa diurut miturut polaritas: banyu < metanol < asetonitril < etanol < tetrahydrofuran < isopropanol.Kanggo njamin penylametan sing apik ing kolom kanggo conto kasebut (kutub kuwat utawa hidrofilik banget), proporsi sistem banyu sing dhuwur kudu digunakake minangka fase seluler.Nanging, nalika nggunakake sistem banyu murni (kalebu banyu murni utawa larutan uyah murni) minangka fase seluler, rantai karbon dawa ing fase stasioner kolom C18 cenderung ngindhari banyu lan nyampur karo siji liyane, nyebabake nyuda cepet ing kapasitas penylametan kolom utawa malah ora penylametan.Fenomena iki diarani "ambruk fase hidrofobik" (kaya sing ditampilake ing sisih kiwa Gambar 1).Sanadyan kahanan iki bisa dibalik nalika kolom dikumbah nganggo pelarut organik kayata metanol utawa asetonitril, nanging isih bisa nyebabake karusakan ing kolom kasebut.Mulane, perlu kanggo nyegah kahanan kasebut.
Gambar 1. Diagram skematik fase ikatan ing permukaan silika gel ing kolom C18 biasa (kiwa) lan kolom C18AQ (tengen).
Kanggo ngatasi masalah kasebut ing ndhuwur, pabrikan bahan kemasan kromatografi wis nggawe perbaikan teknis.Salah sawijining dandan kasebut yaiku nggawe sawetara modifikasi ing permukaan matriks silika, kayata introduksi gugus cyano hidrofilik (kaya sing dituduhake ing sisih tengen Gambar 1), kanggo nggawe permukaan gel silika luwih hidrofilik.Mangkono ranté C18 ing lumahing silika bisa lengkap lengkap ing kahanan banyu banget lan ambruk fase hidrofobik bisa nyingkiri.Kolom C18 sing diowahi iki diarani kolom C18 banyu, yaiku kolom C18AQ, sing dirancang kanggo kondisi elusi banyu banget lan bisa ngidinke sistem banyu 100%.Kolom C18AQ wis akeh diterapake ing pamisahan lan pemurnian senyawa polar sing kuwat, kalebu asam organik, peptida, nukleosida lan vitamin larut banyu.
Desalting iku salah siji saka aplikasi khas kolom C18AQ ing lampu kilat dimurnèkaké kanggo conto, kang mbusak uyah utawa buffer komponen ing solvent sampel kanggo nggampangake aplikasi saka sampel ing pasinaon sakteruse.Ing kirim iki, Brilliant Blue FCF kanthi polaritas kuwat digunakake minangka sampel lan diresiki ing kolom C18AQ.Pelarut sampel diganti karo pelarut organik saka solusi buffer, saéngga nggampangake penguapan rotary ing ngisor iki uga ngirit pelarut lan wektu operasi.Salajengipun, kemurnian sampel ditingkatake kanthi ngilangi sawetara impurities ing sampel.
Bagian Eksperimental
Gambar 2. Struktur kimia sampel.
Brilliant Blue FCF digunakake minangka conto ing kirim iki.Kemurnian sampel mentah yaiku 86% lan struktur kimia sampel ditampilake ing Gambar 2. Kanggo nyiapake solusi sampel, 300 mg bubuk padatan mentah Brilliant Blue FCF dibubarake ing larutan buffer 1 M NaH2PO4 lan digoyang kanthi apik kanggo dadi. solusi rampung cetha.Solusi sampel banjur disuntikake menyang kolom lampu kilat kanthi injektor.Persiyapan eksperimen saka pemurnian lampu kilat kapacak ing Tabel 1.
| Instrumen | Mesin SepaBean™2 | |||
| Kartrid | 12 g Kartrid lampu kilat SepaFlash C18 RP (silika bola, 20 - 45 μm, 100 Å, Nomer pesanan: SW-5222-012-SP) | 12 g Kartrid lampu kilat SepaFlash C18AQ RP (silika bola, 20 - 45 μm, 100 Å, Nomer pesanan:SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| Dawane gelombang | 254 nm | |||
| Fase seluler | Pelarut A: Banyu Pelarut B: Metanol | |||
| Laju aliran | 30 ml/min | |||
| Sample loading | 300 mg (Brilliant Blue FCF kanthi kemurnian 86%) | |||
| Gradien | Wektu (CV) | Pelarut B (%) | Wektu (CV) | Pelarut B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Hasil karo diskusi
Kartrid lampu kilat SepaFlash C18AQ RP digunakake kanggo desalting lan purifikasi sampel.Gradien langkah digunakake ing ngendi banyu murni digunakake minangka fase gerak ing wiwitan elusi lan mlaku kanggo 10 volume kolom (CV).Minangka ditampilake ing Figure 3, nalika nggunakake banyu murni minangka fase seluler, sampel rampung disimpen ing kartrij lampu kilat.Sabanjure, metanol ing fase seluler langsung ditambah dadi 100% lan gradien dipertahankan kanggo 7,5 CV.Sampel dielusi saka 11,5 nganti 13,5 CV.Ing fraksi sing diklumpukake, solusi sampel diganti saka larutan buffer NaH2PO4 dadi metanol.Dibandhingake karo solusi banyu banget, metanol luwih gampang dibusak kanthi penguapan rotary ing langkah sabanjure, sing ndadekake riset ing ngisor iki.
Gambar 3. Kromatogram lampu kilat sampel ing kartrid C18AQ.
Kanggo mbandhingake prilaku penylametan kartrij C18AQ lan kartrij C18 biasa kanggo conto polaritas sing kuat, tes perbandingan paralel ditindakake.Kartrid lampu kilat SepaFlash C18 RP digunakake lan kromatogram lampu kilat kanggo sampel ditampilake ing Gambar 4. Kanggo kartrid C18 biasa, rasio fase banyu sing ditoleransi paling dhuwur yaiku 90%.Mulane gradien wiwitan disetel ing 10% metanol ing 90% banyu.Minangka ditampilake ing Figure 4, amarga fase hidrofobik ambruk rantai C18 disebabake rasio banyu dhuwur, sampel lagi wae disimpen ing cartridge C18 biasa lan langsung eluted metu dening phase mobile.Akibaté, operasi desalting utawa purifikasi sampel ora bisa rampung.
Gambar 4. Kromatogram lampu kilat sampel ing kartrid C18 biasa.
Dibandhingake karo gradien linier, panggunaan gradien langkah nduweni kaluwihan ing ngisor iki:
1. Panggunaan pelarut lan wektu mbukak kanggo pemurnian sampel suda.
2. Produk target elutes ing puncak sing cetha, sing nyuda volume pecahan sing diklumpukake lan kanthi mangkono nggampangake penguapan rotary ing ngisor iki uga ngirit wektu.
3. Produk sing diklumpukake ana ing metanol sing gampang nguap, saéngga wektu pangatusan suda.
Kesimpulane, kanggo pemurnian sampel sing polar banget utawa hidrofilik banget, kartrid lampu kilat SepaFlash C18AQ RP sing digabung karo sistem kromatografi lampu kilat preparatif SepaBean™ Machine bisa menehi solusi sing cepet lan efisien.
Babagan kartrid lampu kilat SepaFlash Bonded Series C18 RP
Ana seri saka SepaFlash C18AQ RP flash cartridges karo specifications beda saka Teknologi Santai (minangka ditampilake ing Tabel 2).
| Nomer Item | Ukuran Kolom | Laju alur (mL/min) | Max. Tekanan (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabel 2. SepaFlash C18AQ RP flash cartridges.
Bahan pengemasan: Silika ikatan bola C18(AQ) efisiensi tinggi, 20 - 45 μm, 100 Å.
log (kaya sing ditampilake ing Tabel 2).
wektu Post: Aug-27-2018