王宏城、徐博
アプリケーション研究開発センター
序章
固定相と移動相の相対的な極性に応じて、液体クロマトグラフィーは順相クロマトグラフィー (NPC) と逆相クロマトグラフィー (RPC) に分類できます。RPC の場合、移動相の極性は固定相の極性よりも強くなります。RPC は、その高効率、優れた分解能、および明確な保持メカニズムにより、液体クロマトグラフィー分離モードで最も広く使用されています。したがって、RPC は、アルカロイド、炭水化物、脂肪酸、ステロイド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質などを含むさまざまな極性または非極性化合物の分離と精製に適しています。RPC で最も一般的に使用される固定相は次のとおりです。シリカゲルマトリックスには、C18、C8、C4、フェニル、シアノ、アミノなどのさまざまな官能基が結合しています。これらの結合官能基の中で最も広く使用されているのはC18です。現在、RPC の 80% 以上が C18 結合相を使用していると推定されています。したがって、C18 クロマトグラフィー カラムは、あらゆる研究室にとって必須の汎用カラムになりました。
C18 カラムは非常に幅広い用途で使用できますが、非常に極性が高いサンプルや親水性が高いサンプルの場合、そのようなサンプルの精製に通常の C18 カラムを使用すると問題が発生する可能性があります。RPC では、一般的に使用される溶出溶媒を極性に従って並べることができます: 水 < メタノール < アセトニトリル < エタノール < テトラヒドロフラン < イソプロパノール。これらのサンプル (極性が強いまたは親水性が高い) をカラム上で良好に保持するには、移動相として高い割合の水系を使用する必要があります。しかし、純水系（純水や純食塩水を含む）を移動相として使用すると、C18カラムの固定相上の長い炭素鎖が水を避けて互いに混ざり合う傾向があり、瞬間的に流量が低下してしまいます。カラムの保持能力、あるいは保持力がない場合もあります。この現象は「疎水性相崩壊」と呼ばれます (図 1 の左側に示すように)。この状況は、カラムをメタノールやアセトニトリルなどの有機溶媒で洗浄すると元に戻りますが、それでもカラムに損傷を与える可能性があります。したがって、このような事態が起こらないようにする必要があります。
図 1. 通常の C18 カラム (左) と C18AQ カラム (右) のシリカゲル表面の結合相の模式図。
上記の問題に対処するために、クロマトグラフィー用充填剤のメーカーは技術的な改良を行ってきました。これらの改善の 1 つは、シリカゲルの表面をより親水性にするために、親水性シアノ基の導入 (図 1 の右側に示すように) など、シリカ マトリックスの表面にいくつかの修飾を加えることです。したがって、シリカ表面上の C18 鎖は、高度に水性の条件下で完全に伸長することができ、疎水性相の崩壊を回避することができました。これらの修飾 C18 カラムは水性 C18 カラム、つまり C18AQ カラムと呼ばれ、高水性溶出条件向けに設計されており、100% 水系に耐えることができます。C18AQ カラムは、有機酸、ペプチド、ヌクレオシド、水溶性ビタミンなどの強極性化合物の分離と精製に広く適用されています。
脱塩は、サンプルのフラッシュ精製における C18AQ カラムの典型的な用途の 1 つであり、サンプル溶媒中の塩または緩衝成分を除去して、その後の研究でのサンプルの適用を容易にします。この記事では、極性の強い Brilliant Blue FCF をサンプルとして使用し、C18AQ カラムで精製しました。サンプル溶媒を緩衝液から有機溶媒に置き換えたため、次のロータリーエバポレーションが容易になり、溶媒と操作時間が節約されました。さらに、サンプル中の一部の不純物を除去することにより、サンプルの純度が向上しました。
実験セクション
図 2. サンプルの化学構造。
この記事では、Brilliant Blue FCF をサンプルとして使用しました。原料サンプルの純度は 86% で、サンプルの化学構造を図 2 に示します。サンプル溶液を調製するために、ブリリアント ブルー FCF の粉末状粗固体 300 mg を 1 M NaH2PO4 緩衝液に溶解し、よく振って、完全に透明な溶液。次に、サンプル溶液をインジェクターによってフラッシュカラムに注入しました。フラッシュ精製の実験設定を表 1 に示します。
| 楽器 | SepaBean™ マシン2 | |||
| カートリッジ | 12 g SepaFlash C18 RP フラッシュ カートリッジ (球状シリカ、20 ～ 45 μm、100 Å、注文番号: SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash C18AQ RP フラッシュ カートリッジ (球状シリカ、20 ～ 45 μm、100 Å、注文番号：SW-5222-012-SP(AQ))） | ||
| 波長 | 254nm | |||
| 移動相 | 溶剤A：水 溶剤B：メタノール | |||
| 流量 | 30mL/分 | |||
| サンプルのロード | 300mg（純度86%のブリリアントブルーFCF） | |||
| 勾配 | 時間（CV） | 溶剤B (%) | 時間（CV） | 溶剤B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
結果と考察
SepaFlash C18AQ RP フラッシュ カートリッジをサンプルの脱塩と精製に使用しました。段階勾配を利用し、溶出の開始時に純水を移動相として使用し、10 カラム容量 (CV) で実行しました。図 3 に示すように、移動相として純水を使用した場合、サンプルはフラッシュ カートリッジ上に完全に保持されました。次に、移動相のメタノールを直接 100% まで増加させ、勾配を 7.5 CV まで維持しました。サンプルは 11.5 ～ 13.5 CV で溶出しました。回収した画分において、試料溶液をNaH2PO4緩衝液からメタノールに置換した。水性の高い溶液と比較して、メタノールは後続のステップでロータリーエバポレーションによって除去するのがはるかに容易であり、これにより次の研究が容易になります。
図 3. C18AQ カートリッジ上のサンプルのフラッシュ クロマトグラム。
強い極性のサンプルに対する C18AQ カートリッジと通常の C18 カートリッジの保持挙動を比較するために、並行比較テストを実行しました。SepaFlash C18 RP フラッシュ カートリッジが使用され、サンプルのフラッシュ クロマトグラムが図 4 に示されています。通常の C18 カートリッジの場合、最大許容水相比は約 90% です。したがって、開始勾配は 90% 水中の 10% メタノールに設定されました。図 4 に示すように、高い水比率による C18 鎖の疎水相崩壊により、サンプルは通常の C18 カートリッジにほとんど保持されず、移動相によって直接溶出されます。その結果、サンプルの脱塩や精製の操作を完了できなくなります。
図 4. 通常の C18 カートリッジ上のサンプルのフラッシュ クロマトグラム。
線形グラデーションと比較して、ステップ グラデーションの使用には次の利点があります。
1. サンプル精製のための溶媒の使用量と実行時間が短縮されます。
2. 目的生成物は鋭いピークで溶出し、収集されるフラクションの量が減少するため、次のロータリーエバポレーションが容易になり、時間を節約できます。
3. 回収された生成物は蒸発しやすいメタノール中にあるため、乾燥時間が短縮されます。
結論として、極性が強いまたは親水性が高いサンプルの精製には、分取フラッシュ クロマトグラフィー システム SepaBean™ Machine と組み合わせた SepaFlash C18AQ RP フラッシュ カートリッジが、高速かつ効率的なソリューションを提供できる可能性があります。
SepaFlash Bonded シリーズ C18 RP フラッシュ カートリッジについて
Santai Technology からは、仕様が異なる一連の SepaFlash C18AQ RP フラッシュ カートリッジがあります (表 2 を参照)。
| 商品番号 | 列のサイズ | 流量 (mL/分) | 最高圧力 (psi/バール) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300グラム | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420g | 40-80 | 250/17.2 |
表 2. SepaFlash C18AQ RP フラッシュ カートリッジ。
充填材: 高効率球状 C18(AQ) 結合シリカ、20 ～ 45 μm、100 Å。
(表 2 を参照)。
投稿日時: 2018 年 8 月 27 日