Rui Huang, Bo Xu
מרכז מחקר ופיתוח יישומים
מבוא
פפטיד הוא תרכובת המורכבת מחומצות אמינו, שלכל אחת מהן תכונות פיזיקליות וכימיות ייחודיות בשל הסוגים והסדר השונות של שאריות חומצות אמינו המרכיבות את הרצף שלה.עם התפתחות סינתזה כימית בשלב מוצק, הסינתזה הכימית של פפטידים פעילים שונים התקדמה מאוד.עם זאת, בשל ההרכב המסובך של הפפטיד המתקבל על ידי סינתזה של פאזה מוצקה, יש לטהר את המוצר הסופי בשיטות הפרדה אמינות.שיטות הטיהור הנפוצות עבור פפטידים כוללות כרומטוגרפיה של חילופי יונים (IEC) וכרומטוגרפיה נוזלית בביצועים הפוכים (RP-HPLC), שיש להן את החסרונות של קיבולת טעינה נמוכה של דגימות, עלות גבוהה של אמצעי הפרדה, ציוד הפרדה מסובך ויקר, ועוד. לטיהור מהיר של פפטידים מולקולות קטנות (MW < 1 kDa), פורסם בעבר מקרה יישום מוצלח על ידי Santai Technologies, שבו נעשה שימוש במחסנית SepaFlash RP C18 לטיהור מהיר של תימופנטין (TP-5) הושג מוצר יעד העומד בדרישות.
איור 1. 20 חומצות אמינו נפוצות (משוכפל מ-www.bachem.com).
ישנם 20 סוגים של חומצות אמינו הנפוצות בהרכב הפפטידים.ניתן לחלק חומצות אמינו אלו לקבוצות הבאות על פי הקוטביות ותכונת הבסיס שלהן: לא קוטביות (הידרופוביות), קוטביות (לא טעונות), חומציות או בסיסיות (כמתואר באיור 1).ברצף פפטיד, אם חומצות האמינו המרכיבות את הרצף הן בעיקר קוטביות (כפי שמסומן בצבע ורוד באיור 1), כגון ציסטאין, גלוטמין, אספרגין, סרין, תראונין, טירוזין וכו', ייתכן שלפפטיד זה יהיה חזק קוטביות ולהיות מסיסים מאוד במים.במהלך הליך הטיהור של דגימות פפטיד קוטבי חזק אלו על ידי כרומטוגרפיה הפוכה, תתרחש תופעה הנקראת קריסת פאזה הידרופוביה (עיין בהערת יישום שפורסמה בעבר על ידי Santai Technologies: Hydrophobic Phase Collapse, AQ Reversed Phase Chromatography Columns and Their Applications).בהשוואה לעמודות C18 הרגילות, עמודות C18AQ המשופרות מתאימות ביותר לטיהור של דגימות קוטביות חזקות או הידרופיליות.בפוסט זה, פפטיד קוטבי חזק נוצל כדגימה וטוהר על ידי עמודת C18AQ.כתוצאה מכך, מוצר היעד העומד בדרישות הושג וניתן היה להשתמש בו במחקר והפיתוח הבאים.
| כלי | SepaBean™מכונה 2 | |||
| מחסניות | מחסנית הבזק SepaFlash C18 RP 12 גרם (סיליקה כדורית, 20 - 45 מיקרומטר, 100 Å, מספר הזמנה: SW-5222-012-SP) | מחסנית הבזק SepaFlash C18AQ RP 12 גרם (סיליקה כדורית, 20 - 45 מיקרומטר, 100 Å, מספר הזמנה：SW-5222-012-SP(AQ)) | ||
| אֹרֶך גַל | 254 ננומטר, 220 ננומטר | 214 ננומטר | ||
| שלב נייד | ממס א': מים ממס B: אצטוניטריל | |||
| קצב זרימה | 15 מ"ל/דקה | 20 מ"ל/דקה | ||
| טעינת מדגם | 30 מ"ג | |||
| מִדרוֹן | זמן (קורות חיים) | ממס B (%) | זמן (דקות) | ממס B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
תוצאות ודיון
כדי להשוות את ביצועי הטיהור של דגימת הפפטידים הקוטבית בין עמודת C18 רגילה ועמודת C18AQ, השתמשנו בעמודה C18 רגילה לטיהור הבזק של הדגימה בתור התחלה.כפי שמוצג באיור 2, עקב קריסת השלב ההידרופובי של שרשראות C18 הנגרמת על ידי יחס מימי גבוה, הדגימה בקושי נשמרה על המחסנית הרגילה C18 ונפלטה החוצה ישירות על ידי הפאזה הניידת.כתוצאה מכך, הדגימה לא הופרדו וטיהרו ביעילות.
איור 2. כרומטוגרמת הבזק של המדגם על מחסנית C18 רגילה.
לאחר מכן, השתמשנו בעמודה C18AQ לטיהור הבזק של המדגם.כפי שמוצג באיור 3, הפפטיד נשמר ביעילות על העמוד ולאחר מכן נחלץ החוצה.מוצר המטרה הופרד מהזיהומים בדגימה הגולמית ונאסף.לאחר ליאופיליזציה ולאחר מכן ניתוח על ידי HPLC, למוצר המטוהר יש טוהר של 98.2% וניתן יהיה לנצל אותו לשלב הבא של מחקר ופיתוח.
איור 3. כרומטוגרמת הבזק של המדגם על מחסנית C18AQ.
לסיכום, מחסנית הבזק SepaFlash C18AQ RP בשילוב עם מערכת הכרומטוגרפיה הבזק SepaBean™מכונה יכולה להציע פתרון מהיר ויעיל לטיהור של דגימות קוטביות חזקות או הידרופיליות.
קיימות סדרות של מחסניות הבזק של SepaFlash C18AQ RP עם מפרטים שונים מ-Santai Technology (כפי שמוצג בטבלה 2).
| מספר פריט | גודל עמודה | קצב זרימה (מ"ל/דקה) | מקסימום לחץ (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 גרם | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 גרם | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 גרם | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 גרם | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 גרם | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 גרם | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 גרם | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 גרם | 40-80 | 250/17.2 |
טבלה 2. מחסניות הבזק של SepaFlash C18AQ RP.חומרי אריזה: סיליקה כדורית בעלת יעילות גבוהה מלוכדת C18(AQ), 20 - 45 מיקרומטר, 100 Å.
למידע נוסף על מפרטים מפורטים של מכונת SepaBean™, או מידע על הזמנה על מחסניות פלאש מסדרת SepaFlash, אנא בקר באתר האינטרנט שלנו.
זמן פרסום: 12 באוקטובר 2018