Rui Huang, Bo Xu
מרכז מו"פ של יישומים
מָבוֹא
פפטיד הוא תרכובת המורכבת מחומצות אמינו, שלכל אחת מהן יש תכונות פיזיקליות וכימיות ייחודיות בגלל הסוגים השונים וסדר של שאריות חומצות אמינו המהוות את רצףו. עם פיתוח סינתזה כימית שלב מוצק, הסינתזה הכימית של פפטידים פעילים שונים התקדמה מאוד. עם זאת, בשל ההרכב המסובך של הפפטיד המתקבל על ידי סינתזת פאזה מוצקה, יש לטהר את התוצר הסופי בשיטות הפרדה אמינות. שיטות הטיהור הנפוצות לפפטידים כוללות כרומטוגרפיה של חילופי יונים (IEC) וכרומטוגרפיה נוזלית גבוהה שלב הפוך (RP-HPLC), שיש להם חסרונות של יכולת העמסה נמוכה לדוגמה, עלות גבוהה של מדיה בהפרדה, ציוד מסובך ויוצא וכו 'עבור טיהור מהיר של פפטידים מולקולה קטנה (MW). מחסנית Sepaflash RP C18 שימשה לטיהור מהיר של התימופנטין (TP-5) ומוצר היעד העומד בדרישות התקבל.
איור 1. 20 חומצות אמינו נפוצות (הוחזרו מ- www.bachem.com).
ישנם 20 סוגים של חומצות אמינו הנפוצות בהרכב הפפטידים. ניתן לחלק את חומצות האמינו הללו לקבוצות הבאות בהתאם לקוטביות שלהן ומאפיין בסיס חומצה: לא קוטבי (הידרופובי), קוטב (לא טעון), חומצי או בסיסי (כפי שמוצג באיור 1). ברצף פפטיד, אם חומצות האמינו המהוות את הרצף הן ברובם קוטביות (כפי שמסומנות בצבע ורוד באיור 1), כמו ציסטאין, גלוטמין, אספרגין, סרין, טרונין, טירוזין וכו '. אז פפטיד זה עשוי להיות בעל קוטביות חזקה ולהיות מסיס מאוד במים. במהלך נוהל הטיהור עבור דגימות פפטיד קוטביות חזקות אלה על ידי כרומטוגרפיה שלב הפוך, תתרחש תופעה הנקראת התמוטטות שלב הידרופובי (עיין בתו אפליקציה שפורסם בעבר על ידי סנטאי טכנולוגיות: התמוטטות שלב הידרופובי, עמודות כרומטוגרפיה שלב הפוכה ויישומם). בהשוואה לעמודות C18 הרגילות, עמודות ה- C18AQ המשופרות מתאימות ביותר לטיהור דגימות קוטביות או הידרופיליות חזקות. בפוסט זה נעשה שימוש בפפטיד קוטבי חזק כמדגם וטוהר על ידי עמוד C18AQ. כתוצאה מכך, מוצר היעד העומד בדרישות הושג וניתן להשתמש בו במחקר ובפיתוח הבא.
| מַכשִׁיר | ספאביאן™מכונה 2 | |||
| מחסניות | 12 גרם מחסנית פלאש C18 RP C18 RP (סיליקה כדורית, 20-45 מיקרומטר, 100 Å, סדר נונבר ： SW-5222-012-SP) | 12 גרם Sepaflash C18AQ RP מחסנית פלאש (סיליקה כדורית, 20-45 מיקרומטר, 100 Å, מספר הזמנה ： SW-5222-012-SP (AQ)) | ||
| אֹרֶך גַל | 254 ננומטר, 220 ננומטר | 214 ננומטר | ||
| שלב נייד | ממס א ': מים ממס B: אצטוניטריל | |||
| קצב זרימה | 15 מ"ל/דקה | 20 מ"ל/דקה | ||
| טעינה לדוגמא | 30 מ"ג | |||
| מִדרוֹן | זמן (קורות חיים) | ממס B (%) | זמן (דקה) | ממס B (%) |
| 0 | 0 | 0 | 4 | |
| 1.0 | 0 | 1.0 | 4 | |
| 10.0 | 6 | 7.5 | 18 | |
| 12.5 | 6 | 13.0 | 18 | |
| 16.5 | 10 | 14.0 | 22 | |
| 19.0 | 41 | 15.5 | 22 | |
| 21.0 | 41 | 18.0 | 38 | |
| / | / | 20.0 | 38 | |
| 22.0 | 87 | |||
| 29.0 | 87 | |||
תוצאות ודיון
כדי להשוות את ביצועי הטיהור עבור מדגם הפפטיד הקוטבי בין עמודת C18 רגילה לעמודה C18AQ, השתמשנו בעמודה C18 רגילה לטיהור הפלאש של המדגם כהתחלה. כפי שמוצג באיור 2, כתוצאה מהתמוטטות השלב ההידרופובי של שרשראות C18 הנגרמות על ידי יחס מימי גבוה, הדגימה בקושי נשמרה על מחסנית C18 הרגילה והוחמקה ישירות על ידי השלב הנייד. כתוצאה מכך, המדגם לא הופרד וטוהר ביעילות.
איור 2 איור 2. כרומטוגרמת הפלאש של הדגימה על מחסנית C18 רגילה.
בשלב הבא השתמשנו בעמודה C18AQ לטיהור הפלאש של הדגימה. כפי שמוצג באיור 3, הפפטיד נשמר ביעילות על העמוד ואז התחמק החוצה. מוצר היעד הופרד מהזיהומים במדגם הגולמי ונאסף. לאחר Lyophization ואז ניתוח על ידי HPLC, למוצר המטוהר טוהר של 98.2% וניתן להשתמש בו עוד יותר למחקר ופיתוח של הצעד הבא.
איור 3 איור 3. כרומטוגרמת הפלאש של הדגימה על מחסנית C18AQ.
לסיכום, Sepaflash C18AQ RP מחסנית פלאש בשילוב עם מערכת הכרומטוגרפיה הפלאית SEPABEAN™המכונה יכולה להציע פיתרון מהיר ויעיל לטיהור דגימות קוטביות או הידרופיליות חזקות.
יש סדרה של מחסניות הפלאש של Sepaflash C18AQ RP עם מפרטים שונים מטכנולוגיית סנטאי (כפי שמוצג בטבלה 2).
| מספר פריט | גודל העמודה | קצב זרימה (ml/min) | מקסימום (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 גרם | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 גרם | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 גרם | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 גרם | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 גרם | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 גרם | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 גרם | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 גרם | 40-80 | 250/17.2 |
טבלה 2. SEPAFLASH C18AQ RP מחסניות פלאש. חומרי אריזה: סיליקה כדורית בעלת יעילות גבוהה (AQ)-סיליקה, 20-45 מיקרומטר, 100 Å.
למידע נוסף על מפרטים מפורטים של מכונת ™ SEPABEAN, או על מידע ההזמנה על מחסניות פלאש של SEPAFLASH, אנא בקרו באתר האינטרנט שלנו.
זמן הודעה: אוקטובר -12-2018