הונגצ'נג וואנג, בו שו
מרכז מחקר ופיתוח יישומים
מבוא
על פי הקוטביות היחסית של שלב נייח ופאזה ניידת, ניתן לחלק את כרומטוגרפיית הנוזלים לכרומטוגרפיה רגילה (NPC) ולכרומטוגרפיה הפוכה (RPC).עבור RPC, הקוטביות של הפאזה הניידת חזקה יותר מזו של הפאזה הנייחת.RPC הפך להיות הנפוץ ביותר במצבי הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית בשל היעילות הגבוהה, הרזולוציה הטובה ומנגנון השמירה הברור שלו.לכן RPC מתאים להפרדה וטיהור של תרכובות קוטביות או לא קוטביות שונות, לרבות אלקלואידים, פחמימות, חומצות שומן, סטרואידים, חומצות גרעין, חומצות אמינו, פפטידים, חלבונים וכו'. ב-RPC, השלב הנייח הנפוץ ביותר הוא מטריצת סיליקה ג'ל הקשורה לקבוצות פונקציונליות שונות, כולל C18, C8, C4, פניל, ציאנו, אמינו וכו'. מבין הקבוצות הפונקציונליות המלוכדות הללו, הנפוצה ביותר היא C18.ההערכה היא שיותר מ-80% מה-RPC משתמשים כעת ב-C18 בונדד phase.לכן עמוד כרומטוגרפיה C18 הפך לעמוד אוניברסלי חובה לכל מעבדה.
למרות שניתן להשתמש בעמודת C18 במגוון רחב מאוד של יישומים, עם זאת, עבור דגימות מסוימות שהן מאוד קוטביות או הידרופיליות מאוד, עמודות C18 רגילות עשויות להיתקל בבעיות בעת שימוש לטיהור דגימות כאלה.ב-RPC, ניתן להזמין את ממיסי הפליטה הנפוצים על פי הקוטביות שלהם: מים < מתנול < אצטון-טריל < אתנול < טטרה-הידרופורן < איזופרפנול.כדי להבטיח שמירה טובה על העמודה עבור דגימות אלה (קוטבי חזק או הידרופילי מאוד), יש צורך בשיעור גבוה של מערכת מימית כדי לשמש כשלב הנייד.עם זאת, כאשר משתמשים במערכת מים טהורים (כולל מים טהורים או תמיסת מלח טהורה) כשלב הנייד, שרשרת הפחמן הארוכה על השלב הנייח של עמודת C18 נוטה להימנע מהמים ולהתערבב זה עם זה, וכתוצאה מכך ירידה מיידית ב- יכולת שמירה של העמוד או אפילו ללא שמירה.תופעה זו נקראת "קריסת פאזה הידרופוביה" (כפי שמוצג בחלק השמאלי של איור 1).למרות שמצב זה הפיך כאשר העמוד נשטף בממיסים אורגניים כגון מתנול או אצטוטריל, הוא עדיין יכול לגרום נזק לעמוד.לכן, יש צורך למנוע מצב זה לקרות.
איור 1. הדיאגרמה הסכמטית של השלבים המחוברים על פני השטח של סיליקה ג'ל בעמודה רגילה C18 (משמאל) ועמודה C18AQ (מימין).
כדי לטפל בבעיות שהוזכרו לעיל, יצרני חומרי האריזה הכרומטוגרפיים ביצעו שיפורים טכניים.אחד השיפורים הללו הוא ביצוע כמה שינויים על פני השטח של מטריצת הסיליקה, כגון החדרת קבוצות ציאנו הידרופיליות (כפי שמוצג בחלק הימני של איור 1), כדי להפוך את פני השטח של סיליקה ג'ל ליותר הידרופיליים.כך ניתן היה להאריך את שרשראות ה-C18 על פני הסיליקה במלואן בתנאים מימיים מאוד ולמנוע את קריסת הפאזות ההידרופוביות.עמודות C18 שהשתנו אלה נקראות עמודות C18 מימיות, כלומר עמודות C18AQ, המיועדות לתנאי אלוציה מימיים מאוד ויכולות לסבול 100% מערכת מימית.עמודות C18AQ יושמו באופן נרחב בהפרדה וטיהור של תרכובות קוטביות חזקות, כולל חומצות אורגניות, פפטידים, נוקלאוזידים וויטמינים מסיסים במים.
הסרת מלח הוא אחד היישומים האופייניים של עמודות C18AQ בטיהור הבזק עבור דגימות, אשר מסיר את רכיבי המלח או החיץ בממס הדגימה כדי להקל על היישום של הדגימה במחקרים הבאים.בפוסט זה, ה-Brillant Blue FCF עם קוטביות חזקה שימש כמדגם ומטוהר בעמודת C18AQ.ממס המדגם הוחלף בממס אורגני מתמיסת חיץ, ובכך הקל על האידוי הסיבובי הבאים וכן חיסכון בממסים ובזמן ההפעלה.יתר על כן, טוהר הדגימה שופר על ידי הסרת כמה זיהומים בדגימה.
חלק ניסיוני
איור 2. המבנה הכימי של המדגם.
ה-FCF הכחול המבריק שימש כמדגם בפוסט זה.הטוהר של הדגימה הגולמית היה 86% והמבנה הכימי של הדגימה הוצג באיור 2. כדי להכין את תמיסת הדגימה, 300 מ"ג מוצק גולמי אבקתי של Brilliant Blue FCF הומס בתמיסת חיץ של 1 M NaH2PO4 ונער היטב כדי להפוך פתרון ברור לחלוטין.תמיסה המדגם הוזרק לאחר מכן לתוך עמודת הבזק על ידי מזרק.ההגדרה הניסיונית של טיהור הבזק מופיעה בטבלה 1.
| כלי | מכונת SepaBean™2 | |||
| מחסניות | מחסנית הבזק SepaFlash C18 RP 12 גרם (סיליקה כדורית, 20 - 45 מיקרומטר, 100 Å, מספר הזמנה: SW-5222-012-SP) | 12 גרם מחסנית הבזק SepaFlash C18AQ RP (סיליקה כדורית, 20 - 45 מיקרומטר, 100 Å, מספר הזמנה：SW-5222-012-SP(AQ)） | ||
| אֹרֶך גַל | 254 ננומטר | |||
| שלב נייד | ממס A: מים ממס B: מתנול | |||
| קצב זרימה | 30 מ"ל/דקה | |||
| טעינת מדגם | 300 מ"ג (Brilliant Blue FCF בטוהר של 86%) | |||
| מִדרוֹן | זמן (קורות חיים) | ממס B (%) | זמן (קורות חיים) | ממס B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
תוצאות ודיון
מחסנית הבזק של SepaFlash C18AQ RP שימשה להסרת דגימות וטיהור.נוצל שיפוע שלב שבו נעשה שימוש במים טהורים כשלב הנייד בתחילת הגלישה והפעילו במשך 10 נפחי עמודות (CV).כפי שמוצג באיור 3, בעת שימוש במים טהורים כשלב הנייד, הדגימה נשמרה לחלוטין על מחסנית ההבזק.לאחר מכן, המתנול בשלב הנייד הוגדל ישירות ל-100% והשיפוע נשמר למשך 7.5 קורות חיים.המדגם נחלץ מ-11.5 ל-13.5 CV.בשברים שנאספו, תמיסת הדגימה הוחלפה מתמיסת חיץ NaH2PO4 למתנול.בהשוואה לתמיסה מימית מאוד, היה הרבה יותר קל להסיר מתנול על ידי אידוי סיבובי בשלב הבא, מה שמקל על המחקר הבא.
איור 3. כרומטוגרמת הבזק של המדגם על מחסנית C18AQ.
כדי להשוות את התנהגות השמירה של מחסנית C18AQ ומחסנית C18 רגילה עבור דוגמאות בעלות קוטביות חזקה, בוצעה בדיקת השוואה מקבילה.נעשה שימוש במחסנית הבזק של SepaFlash C18 RP וכרומטוגרמת ההבזק של המדגם הוצגה באיור 4. עבור מחסניות C18 רגילות, יחס הפאזה המימית הנסבל הגבוה ביותר הוא כ-90%.לכן שיפוע ההתחלה נקבע ל-10% מתנול ב-90% מים.כפי שמוצג באיור 4, עקב קריסת השלב ההידרופובי של שרשראות C18 הנגרמת על ידי יחס מימי גבוה, המדגם בקושי נשמר על המחסנית הרגילה C18 ונפלטה ישירות החוצה על ידי הפאזה הניידת.כתוצאה מכך, לא ניתן להשלים את פעולת הסרת הדגימה או הטיהור.
איור 4. כרומטוגרמת הבזק של המדגם על מחסנית C18 רגילה.
בהשוואה לשיפוע ליניארי, לשימוש בשיפוע צעד יש את היתרונות הבאים:
1. השימוש בממס וזמן הריצה לטיהור מדגם מצטמצמים.
2. תוצר היעד נפלט בשיא חד, מה שמקטין את נפח השברים הנאספים ובכך מקל על האידוי הסיבובי הבאים וגם חוסך זמן.
3. המוצר שנאסף הוא במתנול שקל לאידוי וכך זמן הייבוש מצטמצם.
לסיכום, לטיהור המדגם שהוא מאוד קוטבי או הידרופילי מאוד, מחסניות הבזק של SepaFlash C18AQ RP בשילוב עם מערכת כרומטוגרפיית הבזק ההכנה SepaBean™ Machine יכולים להציע פתרון מהיר ויעיל.
אודות מחסניות הבזק של SepaFlash Bonded Series C18 RP
קיימות סדרות של מחסניות הבזק של SepaFlash C18AQ RP עם מפרטים שונים מ-Santai Technology (כפי שמוצג בטבלה 2).
| מספר פריט | גודל עמודה | קצב זרימה (מ"ל/דקה) | מקסימום לחץ (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5.4 גרם | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 גרם | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 גרם | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 גרם | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 גרם | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP(AQ) | 155 גרם | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP(AQ) | 300 גרם | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP(AQ) | 420 גרם | 40-80 | 250/17.2 |
טבלה 2. מחסניות הבזק של SepaFlash C18AQ RP.
חומרי אריזה: סיליקה מלוכדת כדורית C18(AQ) ביעילות גבוהה, 20 - 45 מיקרומטר, 100 Å.
לוגיה (כפי שמוצג בטבלה 2).
זמן פרסום: 27 באוגוסט 2018