Hongcheng Wang, Bo Xu
Centro di ricerca e sviluppo dell'applicazione
Introduzione
Secondo le polarità relative della fase stazionaria e della fase mobile, la cromatografia liquida può essere divisa in cromatografia di fase normale (NPC) e cromatografia di fase invertita (RPC). Per RPC, la polarità della fase mobile è più forte di quella della fase stazionaria. RPC è diventato il più utilizzato nelle modalità di separazione della cromatografia liquida a causa della sua alta efficienza, buona risoluzione e meccanismo di ritenzione chiara. Pertanto RPC è adatto per la separazione e la purificazione di vari composti polari o non polari, tra cui alcaloidi, carboidrati, acidi grassi, steroidi, acidi nucleici, aminoacidi, peptidi, proteine, ecc. In RPC, la fase stazionaria più comunemente usata è la matrice di gel di silice che è legata a vari gruppi funzionali, compresi C18, C8, folmy, C4 Amino, ecc. Tra questi gruppi funzionali legati, quello più utilizzato è C18. Si stima che oltre l'80% di RPC stia utilizzando la fase legata a C18. Pertanto la colonna di cromatografia C18 è diventata una colonna universale indispensabile per ogni laboratorio.
Sebbene la colonna C18 possa essere utilizzata in una gamma molto ampia di applicazioni, tuttavia, per alcuni campioni che sono molto polari o altamente idrofili, le colonne C18 regolari possono avere problemi quando vengono utilizzate per purificare tali campioni. In RPC, i solventi di eluizione comunemente usati possono essere ordinati in base alla loro polarità: acqua <metanolo <acetonitrile <etanolo <tetraidrofurano <isopropanolo. Per assicurare una buona ritenzione sulla colonna per questi campioni (forte polare o altamente idrofilo), è necessaria un'alta percentuale di sistema acquoso per essere utilizzata come fase mobile. Tuttavia, quando si utilizzano un sistema di acqua pura (compresa l'acqua pura o la soluzione di sale pura) come fase mobile, la lunga catena di carbonio sulla fase stazionaria della colonna C18 tende a evitare l'acqua e si mescola tra loro, con conseguente riduzione istantanea della capacità di ritenzione della colonna o addirittura a nessuna conservazione. Questo fenomeno è chiamato "collasso della fase idrofobica" (come mostrato nella parte sinistra della Figura 1). Sebbene questa situazione sia reversibile quando la colonna viene lavata con solventi organici come metanolo o acetonitrile, può comunque causare danni alla colonna. Pertanto, è necessario impedire che si verifichi questa situazione.
Figura 1. Il diagramma schematico delle fasi legate sulla superficie del gel di silice nella colonna C18 normale (a sinistra) e nella colonna C18AQ (a destra).
Per affrontare i problemi sopra menzionati, i produttori di materiali di imballaggio cromatografici hanno apportato miglioramenti tecnici. Uno di questi miglioramenti è apportare alcune modifiche sulla superficie della matrice di silice, come l'introduzione di gruppi cianofili ciano (come mostrato nella parte destra della Figura 1), per rendere più idrofila la superficie del gel di silice. Pertanto, le catene C18 sulla superficie della silice potrebbero essere completamente estese in condizioni altamente acquose e il collasso della fase idrofobica potrebbe essere evitato. Queste colonne C18 modificate sono chiamate colonne acquose C18, vale a dire colonne C18AQ, che sono progettate per condizioni di eluizione altamente acquosa e possono tollerare il sistema acquoso al 100%. Le colonne C18AQ sono state ampiamente applicate nella separazione e nella purificazione di forti composti polari, tra cui acidi organici, peptidi, nucleosidi e vitamine solubili in acqua.
La desalting è una delle applicazioni tipiche delle colonne C18AQ nella purificazione flash per i campioni, che rimuove i componenti di sale o tampone nel solvente campione per facilitare l'applicazione del campione negli studi successivi. In questo post, il brillante FCF blu con forte polarità è stato usato come campione e purificato sulla colonna C18AQ. Il solvente campione è stato sostituito dal solvente organico dalla soluzione tampone, facilitando così la seguente evaporazione rotante, nonché il salvataggio di solventi e tempo operativo. Inoltre, la purezza del campione è stata migliorata rimuovendo alcune impurità nel campione.
Sezione sperimentale
Figura 2. La struttura chimica del campione.
Il brillante FCF blu è stato usato come campione in questo post. La purezza del campione grezzo era dell'86% e la struttura chimica del campione è stata mostrata nella Figura 2. Per preparare la soluzione del campione, 300 mg di solido grezzo in polvere di FCF blu brillante è stata sciolta in una soluzione tampone NAH2PO4 da 1 M e si è tremato bene per diventare una soluzione completamente chiara. La soluzione di esempio è stata quindi iniettata nella colonna Flash da un iniettore. La configurazione sperimentale della purificazione flash è elencata nella Tabella 1.
| Strumento | Macchina sepabean ™2 | |||
| Cartucce | 12 g SEPAFLASH C18 RP Flash cartuccia (silice sferica, 20-45 μm, 100 Å, numero di ordine: SW-5222-012-SP) | 12 g SEPAFLASH C18AQ RP Flash cartuccia (silice sferica, 20-45 μm, 100 Å, numero d'ordine ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Lunghezza d'onda | 254 nm | |||
| Fase mobile | Solvente a ： Acqua Solvente B ： Metanolo | |||
| Portata | 30 ml/min | |||
| Caricamento del campione | 300 mg (FCF blu brillante con la purezza dell'86%) | |||
| Pendenza | Tempo (CV) | Solvente b (%) | Tempo (CV) | Solvente b (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Risultati e discussione
Una cartuccia flash RP C18AQ RP SEPAFLASH è stata utilizzata per la dissalazione e la purificazione del campione. È stato utilizzato il gradiente di gradini in cui è stata utilizzata l'acqua pura come fase mobile all'inizio dell'eluizione e eseguito per volumi di 10 colonne (CV). Come mostrato nella Figura 3, quando si utilizza l'acqua pura come fase mobile, il campione è stato completamente trattenuto sulla cartuccia flash. Successivamente, il metanolo nella fase mobile è stato direttamente aumentato al 100% e il gradiente è stato mantenuto per 7,5 cv. Il campione è stato eluito da 11,5 a 13,5 cv. Nelle frazioni raccolte, la soluzione campione è stata sostituita dalla soluzione tampone NAH2PO4 al metanolo. Rispetto alla soluzione altamente acquosa, il metanolo è stato molto più facile da rimuovere dall'evaporazione rotativa nella fase successiva, che facilita la seguente ricerca.
Figura 3. Il cromatogramma flash del campione su una cartuccia C18AQ.
Per confrontare il comportamento di ritenzione della cartuccia C18AQ e della cartuccia C18 normale per campioni di forte polarità, è stato eseguito test di confronto parallelo. È stata utilizzata una cartuccia flash C18 RP C18 RP e il cromatogramma flash per il campione è stato mostrato nella Figura 4. Per le cartucce C18 regolari, il rapporto di fase acquosa più alto è di circa il 90%. Pertanto, il gradiente iniziale è stato fissato al 10% di metanolo in acqua al 90%. Come mostrato nella Figura 4, a causa del collasso della fase idrofobica delle catene C18 causate da un alto rapporto acquoso, il campione è stato appena trattenuto sulla cartuccia C18 normale ed è stato eluito direttamente dalla fase mobile. Di conseguenza, non è possibile completare il funzionamento della dissalazione o della purificazione del campione.
Figura 4. Il cromatogramma flash del campione su una cartuccia C18 normale.
Rispetto al gradiente lineare, l'uso del gradiente di gradini presenta i seguenti vantaggi:
1. L'utilizzo del solvente e il tempo di esecuzione per la purificazione del campione sono ridotti.
2. Il prodotto target eluisce in un picco acuto, che riduce il volume delle frazioni raccolte e facilita quindi la seguente evaporazione rotante e risparmiando tempo.
3. Il prodotto raccolto è in metanolo che è facile da essere evaporati, quindi il tempo di asciugatura è ridotto.
In conclusione, per la purificazione del campione che è fortemente polare o altamente idrofilo, le cartucce flash RP C18AQ RP C18AQ che combinano con la macchina Sepabean ™ di cromatografia flash preparativa potrebbe offrire una soluzione rapida ed efficiente.
Informazioni sulle cartucce flash della serie incollate da sepaflash C18 RP
Esistono una serie di cartucce flash RP C18AQ RP Sepaflash con diverse specifiche dalla tecnologia Santai (come mostrato nella Tabella 2).
| Numero articolo | Dimensione della colonna | Portata (ml/min) | Max.pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5,4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabella 2. Sepaflash C18AQ RP Flash Flash.
Materiali di imballaggio: silice sferica ad alta efficienza C18 (AQ), 20-45 μm, 100 Å.
logy (come mostrato nella Tabella 2).
Tempo post: agosto-27-2018