Hongcheng Wang, Bo Xu
Pusat R&D Aplikasi
Perkenalan
Menurut polaritas relatif fase stasioner dan fase gerak, kromatografi cair dapat dibagi menjadi kromatografi fase normal (NPC) dan reversed fase kromatografi (RPC). Untuk RPC, polaritas fase gerak lebih kuat dari pada fase stasioner. RPC telah menjadi yang paling banyak digunakan dalam mode pemisahan kromatografi cair karena efisiensi yang tinggi, resolusi yang baik dan mekanisme retensi yang jelas. Oleh karena itu, RPC cocok untuk pemisahan dan pemurnian berbagai senyawa polar atau non-polar, termasuk alkaloid, karbohidrat, asam lemak, steroid, asam nukleat, asam amino, peptida, protein, cyano, cyano, fase C8, cyan, cyan, cyan, cyan, cyan, cyan, cyan, cyan, cyan, cyan, cyan, cyan, cyan. Amino, dll. Di antara kelompok fungsional terikat ini, yang paling banyak digunakan adalah C18. Diperkirakan lebih dari 80% RPC sekarang menggunakan fase terikat C18. Oleh karena itu kolom kromatografi C18 telah menjadi kolom universal yang harus dimiliki untuk setiap laboratorium.
Meskipun kolom C18 dapat digunakan dalam berbagai aplikasi yang sangat luas, untuk beberapa sampel yang sangat polar atau sangat hidrofilik, kolom C18 biasa mungkin memiliki masalah ketika digunakan untuk memurnikan sampel tersebut. Dalam RPC, pelarut elusi yang umum digunakan dapat dipesan sesuai dengan polaritasnya: air <metanol <asetonitril <etanol <tetrahydrofuran <isopropanol. Untuk memastikan retensi yang baik pada kolom untuk sampel -sampel ini (kutub yang kuat atau sangat hidrofilik), proporsi tinggi sistem air diperlukan untuk digunakan sebagai fase gerak. Namun, ketika menggunakan sistem air murni (termasuk air murni atau larutan garam murni) sebagai fase gerak, rantai karbon panjang pada fase stasioner kolom C18 cenderung menghindari air dan bercampur satu sama lain, menghasilkan penurunan instan dalam kapasitas retensi kolom atau bahkan tidak ada retensi. Fenomena ini disebut "keruntuhan fase hidrofobik" (seperti yang ditunjukkan pada bagian kiri Gambar 1). Meskipun situasi ini dapat dibalik ketika kolom dicuci dengan pelarut organik seperti metanol atau asetonitril, itu masih dapat menyebabkan kerusakan pada kolom. Karena itu, perlu untuk mencegah situasi ini terjadi.
Gambar 1. Diagram skematis dari fase terikat pada permukaan gel silika dalam kolom C18 biasa (kiri) dan kolom C18AQ (kanan).
Untuk mengatasi masalah yang disebutkan di atas, produsen bahan pengemasan kromatografi telah melakukan perbaikan teknis. Salah satu perbaikan ini adalah membuat beberapa modifikasi pada permukaan matriks silika, seperti pengenalan gugus siano hidrofilik (seperti yang ditunjukkan pada bagian kanan Gambar 1), untuk membuat permukaan gel silika lebih hidrofilik. Dengan demikian rantai C18 pada permukaan silika dapat sepenuhnya diperluas dalam kondisi yang sangat berair dan keruntuhan fase hidrofobik dapat dihindari. Kolom C18 yang dimodifikasi ini disebut kolom C18 berair, yaitu kolom C18AQ, yang dirancang untuk kondisi elusi yang sangat berair dan dapat mentolerir sistem air 100%. Kolom C18AQ telah banyak diterapkan dalam pemisahan dan pemurnian senyawa kutub yang kuat, termasuk asam organik, peptida, nukleosida dan vitamin yang larut dalam air.
Desalting adalah salah satu aplikasi khas kolom C18AQ dalam pemurnian flash untuk sampel, yang menghilangkan komponen garam atau buffer dalam pelarut sampel untuk memfasilitasi penerapan sampel dalam studi selanjutnya. Dalam posting ini, FCF biru yang cemerlang dengan polaritas yang kuat digunakan sebagai sampel dan dimurnikan pada kolom C18AQ. Pelarut sampel digantikan oleh pelarut organik dari larutan buffer, sehingga memfasilitasi penguapan putar berikut serta menghemat pelarut dan waktu operasi. Selain itu, kemurnian sampel ditingkatkan dengan menghilangkan beberapa kotoran dalam sampel.
Bagian Eksperimental
Gambar 2. Struktur kimia sampel.
FCF biru yang cemerlang digunakan sebagai sampel dalam posting ini. Kemurnian sampel mentah adalah 86% dan struktur kimia sampel ditunjukkan pada Gambar 2. Untuk menyiapkan larutan sampel, 300 mg padatan minyak mentah bubuk FCF biru brilian dilarutkan dalam larutan buffer 1 M NaH2PO4 dan bergetar dengan baik untuk menjadi larutan yang sama sekali jelas. Solusi sampel kemudian disuntikkan ke kolom flash oleh injektor. Pengaturan eksperimental pemurnian flash tercantum dalam Tabel 1.
| Instrumen | Mesin Sepabean ™2 | |||
| Kartrid | 12 g sepaflash c18 rp flash cartridge (silika bola, 20-45 μm, 100 Å, nomor pesanan: SW-5222-012-sp) | 12 g Sepaflash C18AQ RP Flash Cartridge (Silika Bulat, 20-45 μm, 100 Å, Nomor Pesanan ： SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Panjang gelombang | 254 nm | |||
| Fase gerak | Solvent A ： Air Solvent B: Methanol | |||
| Laju aliran | 30 ml/mnt | |||
| Pemuatan sampel | 300 mg (FCF biru cemerlang dengan kemurnian 86%) | |||
| Gradien | Waktu (CV) | Pelarut b (%) | Waktu (CV) | Pelarut b (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Hasil dan Diskusi
Kartrid Flash RP Sepaflash C18AQ digunakan untuk sampel desalting dan pemurnian. Gradien langkah digunakan di mana air murni digunakan sebagai fase gerak pada awal elusi dan dijalankan selama 10 kolom volume (CV). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, ketika menggunakan air murni sebagai fase gerak, sampel sepenuhnya dipertahankan pada kartrid flash. Selanjutnya, metanol dalam fase gerak secara langsung meningkat menjadi 100% dan gradien dipertahankan untuk 7,5 cV. Sampel dielusi dari 11,5 hingga 13,5 cv. Dalam fraksi yang dikumpulkan, larutan sampel diganti dari larutan buffer NAH2PO4 ke metanol. Dibandingkan dengan larutan yang sangat berair, metanol jauh lebih mudah untuk dihilangkan dengan penguapan putar pada langkah berikutnya, yang memfasilitasi penelitian berikut.
Gambar 3. Kromatogram flash sampel pada kartrid C18AQ.
Untuk membandingkan perilaku retensi kartrid C18AQ dan kartrid C18 reguler untuk sampel polaritas yang kuat, uji perbandingan paralel dilakukan. Kartrid Flash RP Sepaflash C18 digunakan dan kromatogram flash untuk sampel ditunjukkan pada Gambar 4. Untuk kartrid C18 biasa, rasio fase berair yang ditoleransi tertinggi adalah sekitar 90%. Oleh karena itu gradien mulai ditetapkan pada 10% metanol dalam 90% air. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4, karena runtuhnya fase hidrofobik dari rantai C18 yang disebabkan oleh rasio air tinggi, sampel hampir tidak dipertahankan pada kartrid C18 reguler dan secara langsung dielusi oleh fase gerak. Akibatnya, pengoperasian sampel desalting atau pemurnian tidak dapat diselesaikan.
Gambar 4. Kromatogram flash sampel pada kartrid C18 biasa.
Dibandingkan dengan gradien linier, penggunaan gradien langkah memiliki keunggulan berikut:
1. Penggunaan pelarut dan waktu lari untuk pemurnian sampel berkurang.
2. Produk target dialihkan dalam puncak yang tajam, yang mengurangi volume fraksi yang dikumpulkan dan dengan demikian memfasilitasi penguapan putar berikut serta menghemat waktu.
3. Produk yang dikumpulkan dalam metanol yang mudah diuapkan, sehingga waktu pengeringan berkurang.
Sebagai kesimpulan, untuk pemurnian sampel yang sangat polar atau sangat hidrofilik, sepaflash C18AQ RP flash cartridges yang dikombinasikan dengan sistem kromatografi flash preparatif mesin Sepabean ™ dapat menawarkan solusi yang cepat dan efisien.
Tentang Seri Terikat Sepaflash C18 RP Flash Cartridges
Ada serangkaian kartrid flash RP Sepaflash C18AQ dengan spesifikasi berbeda dari teknologi Santai (seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2).
| Nomor item | Ukuran kolom | Laju aliran (ml/mnt) | Max.pressure (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP (AQ) | 5.4 g | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP (AQ) | 20 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP (AQ) | 33 g | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP (AQ) | 48 g | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP (AQ) | 105 g | 25-50 | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 g | 30-60 | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 g | 40-80 | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 g | 40-80 | 250/17.2 |
Tabel 2. Sepaflash C18AQ RP Flash Cartridges.
Bahan Pengepakan: Silika C18 Efisiensi Tinggi (AQ), 20-45 μm, 100 Å.
Logy (seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2).
Waktu posting: AGUG-27-2018