Hongcheng Wang, Bo Xu
Դիմումների R&D կենտրոն
Ներածություն
Ըստ ստացիոնար փուլի և շարժական փուլի հարաբերական բևեռականությունների՝ հեղուկ քրոմատագրությունը կարելի է բաժանել նորմալ փուլային քրոմատոգրաֆիայի (NPC) և հակադարձ փուլային քրոմատոգրաֆիայի (RPC):RPC-ի համար շարժական փուլի բևեռականությունն ավելի ուժեղ է, քան անշարժ փուլինը:RPC-ն դարձել է ամենաշատ օգտագործվողը հեղուկ քրոմատագրության տարանջատման ռեժիմներում՝ շնորհիվ իր բարձր արդյունավետության, լավ լուծաչափի և հստակ պահպանման մեխանիզմի:Հետևաբար, RPC-ն հարմար է տարբեր բևեռային կամ ոչ բևեռային միացությունների բաժանման և մաքրման համար, ներառյալ ալկալոիդները, ածխաջրերը, ճարպաթթուները, ստերոիդները, նուկլեինաթթուները, ամինաթթուները, պեպտիդները, սպիտակուցները և այլն: RPC-ում առավել հաճախ օգտագործվող ստացիոնար փուլն է: սիլիկա գելի մատրիցը, որը կապված է տարբեր ֆունկցիոնալ խմբերի հետ, ներառյալ C18, C8, C4, ֆենիլ, ցիանո, ամինո և այլն:Ենթադրվում է, որ RPC-ի ավելի քան 80%-ն այժմ օգտագործում է C18 կապակցված փուլ:Հետևաբար, C18 քրոմատոգրաֆիայի սյունակը դարձել է պարտադիր ունիվերսալ սյունակ յուրաքանչյուր լաբորատորիայի համար:
Չնայած C18 սյունը կարող է օգտագործվել կիրառությունների շատ լայն շրջանակում, այնուամենայնիվ, որոշ նմուշների համար, որոնք շատ բևեռային կամ բարձր հիդրոֆիլ են, սովորական C18 սյունակները կարող են խնդիրներ ունենալ, երբ օգտագործվում են այդպիսի նմուշները մաքրելու համար:RPC-ում սովորաբար օգտագործվող էլուցիոն լուծիչները կարելի է պատվիրել ըստ իրենց բևեռականության՝ ջուր < մեթանոլ < ացետոնիտրիլ < էթանոլ < տետրահիդրոֆուրան < իզոպրոպանոլ։Այս նմուշների համար սյունակի վրա լավ պահպանում ապահովելու համար (ուժեղ բևեռային կամ բարձր հիդրոֆիլ), ջրային համակարգի մեծ մասնաբաժինը անհրաժեշտ է օգտագործել որպես շարժական փուլ:Այնուամենայնիվ, երբ օգտագործվում է մաքուր ջրի համակարգը (ներառյալ մաքուր ջուրը կամ մաքուր աղի լուծույթը) որպես շարժական փուլ, երկար ածխածնային շղթան C18 սյունակի անշարժ փուլի վրա հակված է խուսափել ջրից և խառնվել միմյանց հետ, ինչը հանգեցնում է ակնթարթային նվազմանը: սյունակի պահպանման հզորությունը կամ նույնիսկ առանց պահպանման:Այս երևույթը կոչվում է «հիդրոֆոբ փուլային փլուզում» (ինչպես ցույց է տրված Նկար 1-ի ձախ մասում):Թեև այս իրավիճակը շրջելի է, երբ սյունը լվանում են օրգանական լուծիչներով, ինչպիսիք են մեթանոլը կամ ացետոնիտրիլը, այն դեռ կարող է վնասել սյունին:Ուստի անհրաժեշտ է կանխել այս իրավիճակի առաջացումը։
Նկար 1. Սիլիկատագելի մակերեսի վրա կապված փուլերի սխեմատիկ դիագրամը սովորական C18 սյունակում (ձախ) և C18AQ սյունակում (աջ):
Վերոնշյալ խնդիրները լուծելու համար քրոմատոգրաֆիկ փաթեթավորման նյութեր արտադրողները կատարել են տեխնիկական բարելավումներ:Այս բարելավումներից մեկը սիլիցիումի մատրիցայի մակերևույթի վրա որոշ փոփոխություններ կատարելն է, ինչպես, օրինակ, հիդրոֆիլ ցիանո խմբերի ներմուծումը (ինչպես ցույց է տրված Նկար 1-ի աջ մասում), սիլիկա գելի մակերեսն ավելի հիդրոֆիլ դարձնելու համար:Այսպիսով, C18 շղթաները սիլիցիումի մակերևույթի վրա կարող են լիովին երկարաձգվել բարձր ջրային պայմաններում և հնարավոր է խուսափել հիդրոֆոբ փուլի փլուզումից:Այս փոփոխված C18 սյունակները կոչվում են ջրային C18 սյունակներ, մասնավորապես C18AQ սյունակներ, որոնք նախատեսված են բարձր ջրային լուծույթի պայմանների համար և կարող են հանդուրժել 100% ջրային համակարգը:C18AQ սյունակները լայնորեն կիրառվում են ուժեղ բևեռային միացությունների, ներառյալ օրգանական թթուների, պեպտիդների, նուկլեոզիդների և ջրում լուծվող վիտամինների բաժանման և մաքրման համար:
Աղազերծումը C18AQ սյունակների բնորոշ կիրառություններից մեկն է նմուշների ֆլեշ մաքրման ժամանակ, որը հեռացնում է աղը կամ բուֆերային բաղադրիչները նմուշի լուծիչից՝ հեշտացնելու համար նմուշի կիրառումը հետագա ուսումնասիրություններում:Այս գրառման մեջ Brilliant Blue FCF-ն ուժեղ բևեռականությամբ օգտագործվել է որպես նմուշ և մաքրվել C18AQ սյունակի վրա:Նմուշի լուծիչը փոխարինվեց բուֆերային լուծույթից ստացված օրգանական լուծիչով, դրանով իսկ հեշտացնելով հետևյալ պտտվող գոլորշիացումը, ինչպես նաև խնայելով լուծիչները և շահագործման ժամանակը:Ավելին, նմուշի մաքրությունը բարելավվեց՝ հեռացնելով նմուշի որոշ կեղտեր:
Փորձարարական բաժին
Նկար 2. Նմուշի քիմիական կառուցվածքը:
Brilliant Blue FCF-ն օգտագործվել է որպես նմուշ այս գրառման մեջ:Հում նմուշի մաքրությունը 86% էր, իսկ նմուշի քիմիական կառուցվածքը ցույց է տրված Նկար 2-ում: Նմուշի լուծույթը պատրաստելու համար Brilliant Blue FCF-ի 300 մգ փոշոտ չմշակված պինդ լուծարեցին 1 M NaH2PO4 բուֆերային լուծույթում և լավ թափահարեցին՝ դառնալու համար: լիովին պարզ լուծում.Նմուշի լուծույթն այնուհետև ներարկիչով ներարկվեց ֆլեշ սյունակ:Ֆլեշ մաքրման փորձնական կարգավորումը ներկայացված է Աղյուսակ 1-ում:
| Գործիք | SepaBean™ մեքենա2 | |||
| Քարթրիջներ | 12 գ SepaFlash C18 RP ֆլեշ քարթրիջ (գնդաձև սիլիցիում, 20 - 45 մկմ, 100 Å, Պատվերի համարը՝ SW-5222-012-SP) | 12 գ SepaFlash C18AQ RP ֆլեշ քարթրիջ (գնդաձև սիլիցիում, 20 - 45 մկմ, 100 Å, Պատվերի համարը՝ SW-5222-012-SP (AQ)） | ||
| Ալիքի երկարություն | 254 նմ | |||
| Շարժական փուլ | Լուծիչ A: Ջուր Լուծիչ B: մեթանոլ | |||
| Հոսքի արագություն | 30 մլ/րոպե | |||
| Նմուշի բեռնում | 300 մգ (Brilliant Blue FCF 86%) մաքրությամբ | |||
| Գրադիենտ | Ժամանակ (CV) | Լուծիչ B (%) | Ժամանակ (CV) | Լուծիչ B (%) |
| 0 | 10 | 0 | 0 | |
| 10 | 10 | 10 | 0 | |
| 10.1 | 100 | 10.1 | 100 | |
| 17.5 | 100 | 17.5 | 100 | |
| 17.6 | 10 | 17.6 | 0 | |
| 22.6 | 10 | 22.6 | 0 | |
Արդյունքներ և քննարկում
Նմուշների աղազերծման և մաքրման համար օգտագործվել է SepaFlash C18AQ RP ֆլեշ քարթրիջ:Օգտագործվել է աստիճանի գրադիենտ, որտեղ մաքուր ջուրն օգտագործվել է որպես շարժական փուլ լուծման սկզբում և աշխատել 10 սյունակի ծավալների համար (CV):Ինչպես ցույց է տրված Նկար 3-ում, մաքուր ջուրը որպես շարժական փուլ օգտագործելիս նմուշն ամբողջությամբ պահվում էր ֆլեշ քարթրիջի վրա:Այնուհետև շարժական փուլում մեթանոլն ուղղակիորեն բարձրացվեց մինչև 100%, իսկ գրադիենտը պահպանվեց 7.5 CV-ի համար:Նմուշը մաքրվել է 11,5-ից մինչև 13,5 CV:Հավաքված ֆրակցիաներում նմուշի լուծույթը NaH2PO4 բուֆերային լուծույթից փոխարինվել է մեթանոլով:Համեմատելով բարձր ջրային լուծույթի հետ՝ մեթանոլը շատ ավելի հեշտ էր հեռացնել հաջորդ քայլում պտտվող գոլորշիացման միջոցով, ինչը հեշտացնում է հետևյալ հետազոտությունը։
Նկար 3. Նմուշի ֆլեշ քրոմատոգրամը C18AQ քարթրիջի վրա:
C18AQ քարթրիջի և սովորական C18 քարթրիջի պահման պահվածքը համեմատելու համար ուժեղ բևեռականության նմուշների համար կատարվել է զուգահեռ համեմատական թեստ:Օգտագործվել է SepaFlash C18 RP ֆլեշ քարթրիջ, և նմուշի ֆլեշ քրոմատոգրամը ներկայացված է Նկար 4-ում: Սովորական C18 փամփուշտների համար ամենաբարձր հանդուրժվող ջրային փուլի հարաբերակցությունը մոտ 90% է:Հետևաբար մեկնարկային գրադիենտը սահմանվել է 10% մեթանոլ 90% ջրի մեջ:Ինչպես ցույց է տրված Նկար 4-ում, C18 շղթաների հիդրոֆոբ փուլի փլուզման պատճառով, որը առաջացել է բարձր ջրային հարաբերակցությամբ, նմուշը հազիվ էր պահվում սովորական C18 քարթրիջի վրա և ուղղակիորեն դուրս էր մղվում շարժական փուլով:Արդյունքում, նմուշների աղազերծման կամ մաքրման գործողությունը չի կարող ավարտվել:
Նկար 4. Նմուշի ֆլեշ քրոմատոգրամը սովորական C18 քարթրիջի վրա:
Համեմատելով գծային գրադիենտի հետ՝ քայլային գրադիենտի օգտագործումն ունի հետևյալ առավելությունները.
1. Նմուշի մաքրման համար լուծիչի օգտագործումը և գործարկման ժամանակը կրճատվում է:
2. Թիրախային արտադրանքը ցողում է սուր գագաթնակետով, ինչը նվազեցնում է հավաքված ֆրակցիաների ծավալը և դրանով իսկ հեշտացնում է հետևյալ պտտվող գոլորշիացումը, ինչպես նաև խնայում է ժամանակը:
3. Հավաքած արտադրանքը գտնվում է մեթանոլի մեջ, որը հեշտ է գոլորշիացնել, ուստի չորացման ժամանակը կրճատվում է:
Եզրափակելով, նմուշի մաքրման համար, որը խիստ բևեռային կամ բարձր հիդրոֆիլ է, SepaFlash C18AQ RP ֆլեշ փամփուշտները, որոնք զուգակցվում են SepaBean™ Machine նախապատրաստական ֆլեշ քրոմատոգրաֆիկ համակարգի հետ, կարող են արագ և արդյունավետ լուծում առաջարկել:
SepaFlash Bonded Series C18 RP ֆլեշ փամփուշտների մասին
Կան SepaFlash C18AQ RP ֆլեշ փամփուշտների մի շարք Santai Technology-ի տարբեր բնութագրերով (ինչպես ցույց է տրված Աղյուսակ 2-ում):
| Նյութի համարը | Սյունակի չափը | Հոսքի արագություն (մլ/րոպե) | Առավելագույն ճնշում (psi/bar) |
| SW-5222-004-SP(AQ) | 5,4 գ | 5-15 | 400/27.5 |
| SW-5222-012-SP(AQ) | 20 գ | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-025-SP(AQ) | 33 գ | 10-25 | 400/27.5 |
| SW-5222-040-SP(AQ) | 48 գ | 15-30 | 400/27.5 |
| SW-5222-080-SP(AQ) | 105 գ | 25-50 թթ | 350/24.0 |
| SW-5222-120-SP (AQ) | 155 գ | 30-60 թթ | 300/20.7 |
| SW-5222-220-SP (AQ) | 300 գ | 40-80 թթ | 300/20.7 |
| SW-5222-330-SP (AQ) | 420 գ | 40-80 թթ | 250/17.2 |
Աղյուսակ 2. SepaFlash C18AQ RP ֆլեշ փամփուշտներ:
Փաթեթավորման նյութեր՝ բարձր արդյունավետ գնդաձև C18(AQ) սիլիցիում, 20 - 45 մկմ, 100 Å:
լոգին (ինչպես ցույց է տրված Աղյուսակ 2-ում):
Հրապարակման ժամանակը՝ օգոստոսի 27-2018